鳙鱼和三文鱼头汤中不同粒径胶粒的抗氧化活性

乐彩虹，苏红，陶宁萍, 2*

1(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)2(上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海，201306)

鳙鱼(Aristichthysnobilis)又名胖头鱼、花鲢、黑鲢，与鲢鱼、草鱼、青鱼并称我国四大家鱼[1]，是中国特有的淡水经济鱼类，有“水中清道夫”的雅称[2]。鳙鱼头富含胶质所以味道特别鲜美[3]，且其头部脑髓和磷脂含量丰富，素有“鳙鱼头，肉馒头”的说法[1]。三文鱼(SalmonSalar)，又名大马哈鱼、鲑鱼、撒蒙鱼，被国际美食界誉为“水中珍品”“冰海之皇”[4]，它的肉质鲜美，营养丰富，含有大量DHA和EPA等[5]。三文鱼在加工过程中会产生大量的副产物，如鱼头、鱼皮和鱼骨等，都有很高的利用价值，对三文鱼副产物的再利用也越来越受到人们的重视[6]，但对鱼头的研究较少。

汤种类众多、味道鲜美、制作便捷[7]。在熬煮过程中经过一系列化学物理反应，汤中的化学成分既有从食品中迁移的原始成分，也有原始成分通过相互作用形成的新成分，这些成分还可以通过分子间次级键相互作用形成新的超分子结构[8]。汤中含有大量水溶性营养成分，可以很容易被吸收，同时也具有各种生物活性。王莉嫦[9]以鲮鱼下脚料为原料，熬煮得到的鲮鱼汤营养成分含量高，味道鲜美。徐红梅[10]研究发现熬煮鳙鱼汤2 h后组织中各营养物质的迁移总量达到最大值。蒋静[11]研究发现在熬煮鲫鱼汤过程中，粗蛋白、水溶性蛋白和氨基酸含量不断增加。田沁等[12]利用电炖锅熬制鲢鱼头汤，在一定条件下，熬制鱼头汤的营养成分和风味成分含量高。HONDA等[13]研究发现受试者摄取干鲣鱼高汤4周后，视觉疲劳主观症状能得到良好的改善。ISHIZAKI等[14]研究发现适量的干鲣鱼高汤能有效改善受试者的不良情绪。黄国榕[15]和张勇[16]研究发现鲫鱼汤具有治疗肝硬化腹水作用和肾脏保护作用。ZHANG等[17]研究了鲫鱼汤和黑鱼汤的营养成分和抗氧化能力，发现黑鱼汤矿物质含量高于鲫鱼汤，但氨基酸总量和抗氧化能力低于鲫鱼汤。

鱼头汤在熬煮的过程中会自组装形成不同粒径大小的微纳胶粒，本文在前期优化熬煮鱼头汤方式[18]的基础上选取熬煮时间为150 min的鳙鱼和三文鱼头汤，通过粗滤、离心、微滤和超滤不同方式处理得到不同粒径大小胶粒的鱼头汤，采用马尔文激光粒度分析仪测定其胶粒的粒径分布，利用6种化学法研究鱼头汤中不同粒径胶粒的体外抗氧化活性，以期为鱼头汤的精深加工提供理论依据，从而创造更大的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验所用原料鳙鱼头、三文鱼头均购自大连翔祥食品有限公司，捕捞于丹麦法罗群岛。大豆油，市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，无水乙醇，FeCl2，菲啰嗪(Ferrozine)，过硫酸钾，磷酸盐(PBS)缓冲液(pH=7.4，pH=6.6)，2,2′-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，HCl，邻苯三酚，H2O2，水杨酸(CH3CH2OH-C7H6O3)，FeSO4，K4Fe(CN)6，FeCl3，三氯乙酸(TCA),均购自上海麦克林生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

C21-WT2112T 美的电磁炉，广东美的网络科技有限公司；UV-2200 紫外分光光度计，美国Unico公司；SLFPTAD Synergy 多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；MS2000 激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；TG16-WS 台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；HWS-24 电热恒温水浴锅，上海恒科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品生物学测量

抽取相近规格大小鳙鱼、三文鱼头各25只，平均头长、头宽、头重见表1。置于-80 ℃冰箱中贮藏待用。

表1 鳙鱼、三文鱼头的生物学测量(湿重, mean±SD,n=25)Table 1 The biochemical indicator of A.nobilis, SalmonSalar head

1.3.2 鱼头汤熬煮

参照QIAN等[19]的方法并稍作修改。鳙鱼和三文鱼头流水解冻后去鳃，分别切成3 cm×3 cm×2 cm的小块，洗净备用。取(20±1)g市售大豆油倒入锅中于电磁炉(120 ℃)上预热30 s，加入鱼头块(400±2)g，煎炸40 s。然后将煎炸鱼头块与3.2 kg饮用水(鱼水质量比为1∶8)倒入不锈钢锅中大火熬煮((97±2)℃)至煮沸后，转小火熬煮((90±2)℃)150 min后弃去鱼头块即得鳙鱼和三文鱼头汤。

1.3.3 鱼头汤胶粒粒径分布

鳙鱼和三文鱼头汤经过滤纸粗滤除去不溶物即为原汤，原汤经10 000 r/min离心15 min取上清液为离心样品，离心样品过0.45 μm水相滤膜为微滤样品，微滤样品经100 kDa超滤膜得到超滤样品，由此共制得4种不同粒径大小的鱼头汤胶粒样品。用MS2000激光粒度分析仪测定经不同方式处理后的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的平均粒径。平均粒径的分布主要通过表面积平均粒径D(3,2)=(Σdi3/Σdi2)、体积平均粒径D(4,3)=(Σdi4/Σdi3)、d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)进行评价(d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)分别表示粒度范围内体积占颗粒总体积的10%，50%和90%时的粒径大小)。

1.3.4 鱼头汤胶粒DPPH·清除率测定

参照ABU BAKAR等[20]的方法并稍作修改。取不同粒径的鳙鱼和三文鱼头汤各1 mL，分别加入DPPH溶液(0.4 mg/mL)1 mL，混合均匀，室温反应30 min后，取200 μL于96孔板中，在酶标仪517 nm处测其吸光值A1(此操作过程应全程严密避光)。以等量的蒸馏水代替样品溶液为空白组，测得吸光度A0，等量的蒸馏水代替DPPH溶液作为对照组，测得吸光度A2。DPPH·清除率计算如公式(1)：

(1)

1.3.5 鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力测定

参照韩娜等[21]的方法并稍作修改。取不同粒径的鳙鱼和三文鱼头汤各1 mL，依次加入50 μL FeCl2(2 mmol/L)、200 μL Ferrozine(5 mmol/L)与2.75 mL蒸馏水混合摇匀，室温下反应10 min，562 nm处测得吸光值A1，以等量的蒸馏水代替样品为空白组，测得吸光度A0，以等量的蒸馏水代替FeCl2为对照组，测得吸光度A2。Fe2+螯合能力的计算如公式(2)：

(2)

1.3.6 鱼头汤胶粒ABTS+·清除率测定

参照白海娜等[22]的方法并稍作修改。取5 mL ABTS溶液(7 mm)和88 μL过硫酸钾溶液(140 mm)混合，并在室温条件下避光放置12～16 h，作为ABTS+·储备液，用蒸馏水稀释ABTS+·储备液至其在734 nm波长的吸光度为0.700±0.005(大约稀释50倍)，作为ABTS+·工作液。取ABTS自由基工作液4 mL，加入不同粒径的鳙鱼和三文鱼头汤各40 μL，室温避光反应10 min后在734 nm处测得吸光值A1，以等量的蒸馏水代替样品为空白组，测得吸光度A0，以等量的蒸馏水代替ABTS工作液为对照组，测得吸光度A2。ABTS+·清除率的计算如公式(3)：

(3)

(4)

1.3.8 鱼头汤胶粒·OH清除率测定

参照LAI等[24]的方法并稍作修改。取不同粒径的鳙鱼和三文鱼头汤各1 mL，依次加入FeSO4、CH3CH2OH—C7H6O3、H2O2、H2O各1 mL，混匀启动反应，在37 ℃培养箱中反应30 min后取上清液在510 nm处测得吸光值A1，以等量的蒸馏水代替样品为空白组，测得吸光度A0，以等量的蒸馏水代替H2O2溶液为对照组，测得吸光度A2，·OH清除率的计算如公式(5)：

(5)

1.3.9 鱼头汤胶粒总还原能力测定

参照陈静等[25]的方法并稍作修改。取不同粒径的鳙鱼和三文鱼头汤各0.5 mL，加入2.5 mL PBS缓冲液(0.2 mol/L，pH=6.6)和2.5 mL K4Fe(CN)6(1%)混匀，在50 ℃的水浴中反应20 min，迅速冷却后加入2.5 mL TCA(10%)，混匀后在3 000 r/min下离心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL H2O和1 mL FeCl3(0.1%)混匀，室温放置10 min后于700 nm处测其吸光值。

1.4 数据分析

所有实验均重复3次，结果以平均值±标准偏差(mean±SD)的形式表示。采用SPSS 16.0软件，根据单因素方差(One-Way ANOVA)方法对数据进行差异显著性比较分析，P<0.05为数据之间存在显著性差异。Origin 8.0(Origin Lab，USA)软件用于处理和生成图像。

2 结果与分析

2.1 不同方式处理的鱼头汤胶粒粒径分布

如果D(3,2)和D(4,3)的值接近，则颗粒的形状将更加规则并且分布更加集中；如果值之间的差异很大，则分布将更宽。由表2可知，随着处理方法的不同，鳙鱼头汤和三文鱼头汤形成胶粒的平均粒径显著变小，并且三文鱼头汤胶粒的平均粒径大于鳙鱼头汤，可能与三文鱼是海水鱼，含有更高浓度的油脂有关。鳙鱼和三文鱼头原汤胶粒的粒径分布范围比较大，10 000 r/min离心15 min后，鳙鱼头汤和三文鱼头汤胶粒的各粒径参数都有显著性变化(P<0.05)，说明汤经过离心之后平均粒径显著变小，在通过0.45 μm的滤膜微滤和100 kDa的超滤离心管超滤之后，较大的颗粒在膜过滤过程中被滤膜截留，而较小的颗粒则通过膜，平均粒径变得非常小。所以，经过不同方式处理后鱼头汤胶粒分布粒径大小不同，这为之后研究鱼头汤中不同粒径胶粒与其抗氧化活性之间的关系提供参考。

表2 不同方式处理的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒粒径分布Table 2 Colloidal particle size distribution of A. nobilis and Salmon Salar head soup with different treatment methods

注：上标小写字母表示不同处理方式之间具有显著性差异，上标大写字母表示不同鱼汤之间具有显著性差异，P<0.05

2.2 不同方式处理鱼头汤胶粒的抗氧化活性

DPPH·是一种稳定的以氮原子为中心的自由基，它的稳定性来源于空间障碍和3个苯环的共振稳定作用，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥电子成对作用[26]。DPPH的醇溶液为深紫色，在517 nm处有最大吸收峰，当体系中存在自由基清除剂时，氮原子上的孤电子被配对，DPPH·便会被还原成黄色的DPPH-H非自由基的形式[27]。

图1为不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的DPPH·清除率。由图1可知，处理方式不同，样品的DPPH·清除率之间存在明显差别。具体表现为鳙鱼头和三文鱼头原汤胶粒DPPH·清除率显著高于离心、微滤和超滤鱼头汤(P<0.05)，并且经过离心和微滤的鱼头汤胶粒DPPH·清除率显著高于超滤后的鱼头汤(P<0.05)，这与分布的结果一致，表明在一系列处理过程中，大部分大颗粒物质被截留，有效活性物质也被截留，导致其DPPH·清除率减小。鳙鱼头和三文鱼头的原汤和微滤样品胶粒DPPH·清除率不存在显著性差别(P>0.05)，但离心和超滤样品胶粒DPPH·清除率存在显著性差别(P<0.05)，且2种鱼头汤胶粒DPPH·清除率均表现为原汤>离心>微滤>超滤。

图1 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的DPPH·清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of A. nobilisand Salmon Salar head soup colloidal with differenttreatment methods注：上标小写字母表示不同处理方式之间具有显著性差异，上标大写字母表示不同鱼汤之间具有显著性差异，P<0.05(下同)

图2 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的清除率 scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salarhead soup colloidal with different treatment methods

Fe2+能够与抗氧化剂发生鳌合反应[29]，避免了Fe2+与H2O2发生Fenton反应而产生自由基，在反应结束时，在反应体系中加入Ferrozine试剂，没有被螯合的Fe2+会与Ferrozine试剂反应生成有色基团，该有色基团在563 nm处有强的吸收峰，从而能够间接反映鱼头汤的抗氧化能力。

图3为不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的Fe2+螯合能力。由图3可知，鳙鱼头原汤与离心鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力不存在显著性差异(P>0.05)，但都显著性高于微滤与超滤鱼头汤(P<0.05)，微滤鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力显著性高于超滤鱼头汤(P<0.05)；不同粒径的三文鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力之间存在显著性差异(P<0.05)。两种鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力均表现为原汤>离心>微滤>超滤。而且不同粒径鳙鱼头汤胶粒Fe2+螯合能力均大于三文鱼头汤。ZHANG等[17]用同种方法测定了鲫鱼汤和黑鱼汤原汤经过模拟体外消化后的抗氧化活性，经对比可知，鳙鱼头汤Fe2+螯合率高于鲫鱼汤(60.05%)和黑鱼汤(43.48%)，但鲫鱼汤和黑鱼汤Fe2+螯合率高于三文鱼头汤。

图3 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的Fe2+螯合率Fig.3 The Fe2+ chelation rate of A. nobilis and Salmon Salarhead soup colloidal with different treatment methods

ABTS+·是一种人工合成的自由基，其在氧化剂的作用下会生成绿色的阳离子ABTS+·，该自由基在734 nm处有吸收峰[30]。若反应体系中含有抗氧化剂，则会抑制ABTS+·的产生，从而间接反映样品抗氧化能力的大小。

图4为不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的ABTS+·清除率。由图4可知，鳙鱼头原汤胶粒ABTS+·清除率显著性高于离心、微滤和超滤鱼头汤(P<0.05)，离心与微滤鱼头汤胶粒ABTS+·清除率无显著性差异(P>0.05)，但都显著高于超滤鱼头汤(P<0.05)；三文鱼头原汤、离心与微滤鱼头汤胶粒ABTS+·清除率不存在显著差异(P>0.05)，但都显著性高于超滤鱼头汤(P<0.05)。2种鱼头汤胶粒ABTS+·清除率均表现为原汤>离心>微滤>超滤，且不同粒径鳙鱼头汤胶粒ABTS+·清除率均大于三文鱼头汤，这与鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的Fe2+螯合能力的结果一致。

图4 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的ABTS+·清除率Fig.4 ABTS+· scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

·OH能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物[16]，它是迄今发现最活跃的自由基之一，可以快速有效的氧化几乎所有化合物[32]。利用Fe2+与H2O2发生Fenton反应而产生·OH[33]，它能够与水杨酸反应产生2,3-二羟基苯甲酸，其在510 nm处有最大吸收峰。

图5为不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的·OH清除率。由图5可知，鳙鱼头原汤与离心鱼头汤胶粒·OH清除率不存在显著性差异(P>0.05)，但都显著高于微滤与超滤鱼头汤(P<0.05)，且微滤与超滤鱼头汤胶粒·OH清除率不存在显著性差异(P>0.05)；三文鱼头原汤、离心与微滤鱼头汤胶粒·OH清除率不存在显著性差异(P>0.05)，但都显著性高于超滤鱼头汤(P<0.05)，且不同粒径三文鱼头汤胶粒·OH清除率高于鳙鱼头汤。

图5 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的·OH清除率Fig.5 The hydroxyl free radical scavenging rate of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

样品的抗氧化剂能使K4Fe(CN)6的Fe3+还原成Fe2+[KFe(CN)3]，Fe2+进一步和FeCl3反应生成在700 nm处有最大吸光度的普鲁士蓝Fe4[Fe(CN)6]3，因此测定700 nm处的高低可以间接反映抗氧化剂的还原能力大小，吸光度越大，还原能力越强[34]。反应式如下：

3K4Fe(CN)6+4FeCl3→Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl

图6为不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的总还原能力。由图6可知，鳙鱼头原汤与离心鱼头汤胶粒总还原能力不存在显著性差异(P>0.05)，但都显著高于微滤与超滤鱼头汤(P<0.05)，且超滤鱼头汤胶粒显著高于微滤鱼头汤(P<0.05)；三文鱼头原汤胶粒总还原能力显著性高于离心、微滤与超滤鱼头汤(P<0.05)，离心与微滤鱼头汤胶粒总还原能力不存在显著性差异(P>0.05)，但都显著高于超滤鱼头汤(P<0.05)。而且不同粒径三文鱼头汤胶粒的总还原能力均大于鳙鱼头汤，这与鳙鱼和三文鱼头汤胶粒·OH清除率的结果一致。

图6 不同处理方式的鳙鱼和三文鱼头汤胶粒的总还原能力Fig.6 The total reducing power of A. nobilis and Salmon Salar head soup colloidal with different treatment methods

3 结论