茜素绿-蛋白质-Cu(Ⅱ)三元络合物瑞利散射光谱研究

高俊杰，魏恺莹，陈 达

(沈阳理工大学 环境与化学工程学院，沈阳 110159)

蛋白质是人体生命活动的物质基础[1]，也是人体中的机体组织及各项器官重要组成部分，且参与人体生命活动的整个过程中[2]。人体需要从食品中摄取大量蛋白质，为生命活动提供所需的能量。蛋白质的测定方法有凯氏定氮法[3]、考马斯亮蓝(Bradford)法[4]、荧光法[5]、共振瑞利散射法等[6]。

染料与蛋白质反应的产物通过荧光法、共振瑞利散射法测定的方法很多，大多是以形成二元络合物为主。如果在反应体系中加入金属离子，使其形成染料-金属配合物，比使用单一试剂的灵敏度要高，结合要强。因此，三元络合物体系具有广大的研究空间[7-8]。

茜素绿又叫酸性绿25(AG25)，是一种常用的蒽醌染料、生物染色剂，也用于光度法的显色剂等，其与蛋白质的反应已经用于光度法、瑞利散射法的检测中[9]，但都局限在二元体系中，形成三元络合物的瑞利散射法还未见报道。本文在二元反应体系中加入铜离子，在一定条件下形成三元络合物，使测定灵敏度大大增加，建立测定蛋白质的新方法，通过对实际样品的蛋白质含量测定，结果满意。

1 实验部分

1.1 实验仪器及试剂

日立F-2500荧光分光光度计(日立公司，日本)，pHS-3C酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；2×10-2g/L牛血清白蛋白标准溶液(BSA)；2×10-2g/L卵白蛋白标准溶液(Ova)；4×10-2g/L茜素绿溶液；B-R缓冲溶液；0.1g/L硫酸铜溶液。

所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

于10mL比色管中依次加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液、适量的蛋白质溶液、1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)、1mL的0.1g/L硫酸铜溶液，再用蒸馏水稀释至刻度，并充分摇匀后静置15min待测。

荧光分光光度计设定以λex=λem在一定波长范围进行同步扫描(激发狭缝宽度与发射狭缝宽度均为5.0nm)，记录系统的共振瑞利散射光谱，并于最大共振瑞利散射处(370nm)测得络合物散射光强度I和试剂空白的散射光强度I0，计算测量相对强度ΔI，ΔI=I-I0。

2 结果与讨论

2.1 共振瑞利散射光谱

按实验方法测定共振瑞利散射谱，如图1所示。

图1中，在370nm与468nm处出现两个RRS峰，其中370nm处有更高的散射光强度，且空白值低，具有更高的灵敏度和准确性。因此，测定蛋白质含量时选择370nm处散射光强度作为测量值。测定蛋白质体系时，三元体系(曲线5)比二元体系(曲线4)有更强散射光强度。

2.2 反应条件的优化

2.2.1 B-R缓冲液酸度的影响

实验不同酸度对三元络合物体系散射光强度的影响。保持其他反应条件不变，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液、1mL的0.1g/L硫酸铜溶液、1mL不同酸度的B-R缓冲溶液，如图2所示，结果显示pH=4.35时得到的散射强度数值最大，因此宜选择pH=4.35的B-R缓冲溶液。

2.2.2 B-R缓冲液用量的影响

按实验方法测定不同缓冲溶液用量的影响，保持其他反应条件不变，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液、1mL的0.1g/L硫酸铜溶液，如图3所示。结果表明B-R缓冲溶液用量在1mL时效果最好，因此B-R缓冲溶液缓冲溶液用量宜选为1mL。

2.2.3 染料茜素绿用量的影响

保持其他反应条件不变，每份固定加入1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)、1mL的0.1g/L硫酸铜溶液。按实验方法在一定范围内改变茜素绿用量，测定相对共振瑞利散射强度相应的变化，如图4所示。结果表明茜素绿用量在1.5mL时效果最好，故茜素绿用量宜取为1.5mL。

2.2.4 铜离子用量的影响

保持其他反应条件不变，每份固定加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液、1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)。测试铜离子用量对体系的影响，如图5所示。结果表明，随着铜离子的增加，体系散射强度不断增加，当达到1mL(0.1g/L的硫酸铜溶液)后强度不再增加，故铜离子用量宜取为1mL。

2.2.5 反应温度的影响

加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液，1mL的0.1g/L硫酸铜溶液，1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)。测定在不同温度时反应体系的散射强度，如图6所示。结果显示在10～50℃时基本稳定，当温度继续升高时，散射强度有显著提升；但要考虑蛋白质易变性的特点，温度过高，蛋白质失活。因此温度选择在室温的条件下进行即可。

2.2.6 反应时间的影响

实验加入1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液，1mL的0.1g/L硫酸铜溶液，1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)。测试反应时间的影响，如图7所示。结果表明，在10～30min时，溶液反应完全，体系呈稳定状态，测量的荧光强度基本稳定。随着反应时间的延长，体系的散射光强度开始降低，故最佳的反应时间为15min。

2.2.7 试剂加入顺序的影响

不同的试剂加入顺序会影响体系的组成与稳定性，对实验所测量的散射光强度也会造成影响。按照表1中不同的加入顺序进行测定、分析。实验结果如图8所示。

表1 试剂加入顺序对体系散射光强度的影响

由表1和图8可知，最佳加入顺序应为第2组(茜素绿、蛋白质、B-R缓冲溶液、铜)，此种加入顺序效果最好，灵敏度最高。

2.2.8 离子强度的影响

通过向1.5mL的4×10-2g/L茜素绿溶液、蛋白质、1mL的0.1g/L硫酸铜溶液、1mL的B-R缓冲溶液(pH=4.35)组成的三元络合物体系中添加不同浓度的氯化钠溶液，改变体系的离子强度。实验结果(如图9所示)表明，改变氯化钠浓度对试剂空白影响不大，但三元络合物体系会产生影响。当氯化钠浓度小于3.42×10-3mol/L时，相对共振瑞利散射强度几乎没有变化。但当氯化钠浓度大于3.42×10-3mol/L时，随着氯化钠浓度的进一步增加，散射强度出现明显减小。因此，当溶液中离子强度稍大时会对体系造成影响，离子会竞争结合蛋白质，也会屏蔽茜素绿与蛋白质的电荷，使茜素绿与蛋白质的结合力降低。产生的这一现象也可表明，茜素绿与蛋白质的结合力有一部分是静电引力作用的。实验中如果离子强度变化较大时应考虑其影响。

2.2.9 络合物组成的测定

按实验方法，以Cu(Ⅱ)与茜素绿的摩尔比为横坐标，以散射光强度为纵坐标，试验不同比例下的散射光强度，如图10所示。结果表明，当铜离子与茜素绿摩尔比为4∶1时，测定值出现了拐点，故Cu(Ⅱ)与茜素绿的摩尔比，即络合物组成比宜取为4∶1。

2.2.10 共存物质的影响

表2 共存物质对茜素绿-蛋白质-Cu(Ⅱ)三元络合物体系散射光强度的影响

3 线性回归方程

在优化反应条件下，按实验方法对不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)与卵蛋白(Ova)溶液进行测定，绘制标准工作曲线的线性回归方程检出限，相关系数如表3所示(浓度点n=5)。

表3 两种蛋白质标准工作曲线

由表3可知，两种蛋白质标准曲线的检出限都在0.16mg/L以内，相关系数都在0.99以上，因此这种测定蛋白质含量的方法灵敏度与准确度都较高。

4 样品的测定

测定两种蛋白：动物蛋白(牛奶)、植物蛋白(豆浆)样品中的总蛋白质。将样品稀释2000倍，分取适量溶液按实验方法测定，同时做加标回收率实验，结果如表4所示(n=5)。

表4 样品中蛋白质测定结果及回收率

由表4看出，测得的两种样品的加标回收率都在96%以上，相对偏差较小。因此共振瑞利散射法测定蛋白质含量同样具有可行性与准确性。

5 结论

实验建立了一种三元络合物体系共振瑞丽散射测定蛋白质的新方法，三元络合物体系比二元体系灵敏度更高。实际样品的测定也表明此方法有较高的灵敏度和准确度，可以准确测定不同样品中的蛋白质含量，结果满意。此方法应用于牛奶、豆浆等样品中的蛋白质的含量，有很好的应用性。