蛋白质分离纯化技术研究现状与发展趋势研究

刘奕飞 李明宇

【摘 要】蛋白质是生命活动的物质基础，是各种生物、各种复杂功能和各种生物大分子的组成成分。蛋白质是生物科学的重要研究对象，如何分离纯化蛋白质是生命科学研究的重点之一。以前，没有办法从复杂的混合物中提取蛋白质。然而，随着科学研究实验的进行和发展，对于每一种蛋白质，都可以选择分离的方法来生产高纯度的产品，其基本手段也很普遍。本文综述了现有的蛋白质分离纯化技术的发展状况并以某些蛋白提取为例进行举例分析提出了各项技术分析结果，总结了现有蛋白质分离纯化技术的发展状况并以蛋白提取物进行举例分析，为以后研究提纯蛋白质提供参考方法。

【关键词】蛋白质;纯化方法;分离技术

蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的结构、化学成分和生物学功能的基础。很明显，要从复杂的体系中提取蛋白质，同时防止其组成、结构、理化性质的变化以及生物活性的丧失是相当困难的。目前，蛋白质分离纯化技术的发展趋向于更加细节化、多样化技术的综合使用，但这些方法的基本原理不变，都是以蛋白质的性质作为参考依据。本文主要针对近年来动物蛋白纯化方法的应用做了一个综述，并以以往的具体实验作了参考，详细记录了所用的方法，但要了解的是，在具体的实际工作中应依据不同的要求和实验条件下操作，主要为以后工作者的研究提供参考方法。

1蛋白质的分离纯化提取处理方式

1.1动物组织的细胞破碎

实验前我们的材料往往是动物的组织，所以第一步是破坏动物组织的细胞，除去大块的组织块，主要的方法是物理、化学和生物化学的方法。物理方法分为机械方法和非机械方法。机械方法最常用的是研磨法和匀浆法，主要用机械力粉碎组织细胞。非机械方法主要是通过各种物理要素粉碎组织细胞，有冻结熔化法、超声波法等。广泛应用于实验室的是超声波破碎技术，其优点是处理少量样品时操作简便，节约液体材料。但是，由超声波产生的化学自由基团可以使某些敏感活性物质变性以及失活，所以处理一些超声波敏感蛋白酶时应慎重使用。

1.2动物组织中蛋白质的溶剂提取

大多数动物蛋白溶于稀盐、酸、碱液或水中，但也有一些和脂肪结合的脂肪蛋白易溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。通常用含盐的碳氢化合物水溶液，对蛋白质具有高且稳定的水溶性，例如Nacl为溶液，它有利于动物蛋白的溶解，并且，在盐和蛋白质的结合中，提供了对不硬化特性的保护。碱性蛋白质通常可以用酸性溶液进行提取，酸性蛋白则相反。对陈思聪[3]等人在提取鲢鱼中鱼肉蛋白质时，因为鲢鱼中鱼肉蛋白属于碱性蛋白，所以用偏酸性溶液进行提取，产率达90%左右。

1.2.1水溶液提取法

蛋白质依赖于在溶液中的溶解度，如Na2PO4-NaOH提取马尾松毛虫幼虫的蛋白，提取时注意需要搅拌均匀，使蛋白质充分溶解，从利于蛋白的沉淀方面考虑，温度要设置在5℃以下操作，由于蛋白质是两性电解质，所以ph值也会影响沉淀，研究发现，若把蛋白质ph控制在等电点0.5ph以上时，蛋白质的溶解度随之增加。用此法提取的蛋白测含氮量比稀碱法大大提高。

2蛋白质纯化方法及研究现状

2.1依据蛋白质分子的大小差异的分离技术

2.1.1离心技术

离心技术广泛应用于各个领域，是分离纯化蛋白的重要方法之一，往往需要和其他分离方法共同作用，达到进一步纯化分析的目的，包括如差速离心，密度梯度离心等多种方法，差速离心技术室是依据物质分子沉降速度的差异，在实验过程中将离心机速度由低速到高速逐级递增，蛋白分子会依次沉降下来，达到分离效果，其特点是离心时间短，但需要反復多次离心尚可达到效果，所得的产物纯度也较低，常用于病毒、亚细胞结构的分离纯化;密度梯度离心是依据沉降速度的差异和浮力密度的差异来进行分析分离的技术，离心速度固定不变，离心时间长，所得产物纯度高，易悬浮且生成区带，主要用于对核酸、蛋白质复合体、细胞、病毒等物质的分离纯化。

2.1.2凝胶层析技术

凝胶层析又叫分子筛过滤，凝胶具有惰性载体的性质，通常所带电荷为零且具有较弱的吸附能力，在较温和的操作环境下进行，实验环境对温度要求范围广，可以不需要有机溶剂，同样能保持蛋白质活性和理化性质，分子筛凝胶的筛孔大小有区别，所以，把凝胶制成凝胶柱，并且柱子的长度够长，便会起到“筛子”的作用。具体过程为：蛋白质有形状、分子量等区别，当大分子的蛋白质通过凝胶柱时，不会进入凝胶分子筛的内部，而小分子的蛋白会进去凝胶分子筛内部，结果便是大分子蛋白由于所经的路径短会先洗脱下来，而小分子量的蛋白由于会先进入分子筛的内部，这样凝胶会阻碍蛋白分子的运动，所经路径长，所以小分子蛋白会后洗脱下来。这种方法对大小物质的筛选能起到很好的筛离功效。所以凝胶层析是根据物质分子量大小来进行分离的手段，因此又称之为凝胶过滤或排阻层析等。

2.1.3超滤技术

超滤技术是一种以超滤膜为介质的分离技术，膜俩侧有压力差，这是分离的驱动力，膜的材质对膜分离性能起着重要决定作用，膜的上层为活化层，其厚度约0.1-1.0微米，很薄，决定了膜孔径较小，能很好的截流小分子粒子;下层是支撑层，主要对膜的强度起作用。在蛋白质分离纯化中超滤技术具有方便实施，难度相对较小，成本低，效率高等优势，除此之外，在蛋白质的脱盐，脱醇，分离分离，内霉素去除等过程中也有广阔的应用前景。超滤技术成功应用于干酪乳清和大豆乳清中蛋白的脱盐和回收，蛋白截留率高达94.65%;超滤技术用于鸡蛋蛋清蛋白的分离，具体经过俩次纯化步骤，可得到高纯度蛋白，这也是根据蛋白分子量的大小不同的性质来进行的，此法获得的蛋白纯度为98.7%，含45%的卵清蛋白。超滤技术虽优势明显，但实验过程易产生浓度极化和膜污染等情况，也是目前亟待解决的问题。

2.2改变蛋白质的溶解度的分离纯化技术

2.2.1溶剂法

在有机溶剂提取法在实验室中常用于实验植物蛋白的提取，例如昂贵的中草药中有效成分的提取，当将溶剂加入到提前准备的植物材料中时，溶剂会通过细胞壁扩散入细胞内，可溶性物质即被溶解，溶于有机溶剂中，依据的是相似相溶原理。之后可以采用一定的方法将有机溶剂去除，例如加热蒸发，经干燥即可获得制品，产量可观，但在实验过程中需注意溶剂对人体的危害，避免皮肤直接接触，除此之外，要保持提取物的分散度，这样可把所需物质几乎全部析出。

2.2.2双水相萃取法

根据亲和水性高分子聚合物实际用途，分析水溶液的浓度，形成两相的结构，当两种聚合物，一种聚合物与适当浓度或特定温度下的亲液盐或是两种盐（一种是离散盐，另一种是亲液盐）在双水相体系中混合形成，其中，水的比例较高，可以形成二水项相关系统。在使用此类方式的过程中，应要具体操作，对蛋白质分析技术进行正规的改革，全面优化处理方式。

2.2.3盐溶法及盐析法

盐析方式在使用期间，主要应用高浓度的中性盐成分，对蛋白质溶液进行合理的处理后，使离析工作效果能符合规定。最为常用的材料为：硫酸铵成分、硫酸钠成分与氯化钠成分等。在实际实验的过程中，高浓度中性盐能够对蛋白质进行分离，去除水花莫物质，并破坏其稳定性。在实际离析期间，需根据蛋白质的实际特点，采取不同的方式对其处理，保证PH值在合理范围内。同时，在离析期间需保证PH值稳定性，通常情况下，在PH值超过7.1的时候。血清蛋白质与硫酸铵相互融合，就可以沉淀。达到良好的处理效果。同时，在使用此类方式的过程中，还要针对蛋白质的实际分离要求，对其进行合理的分析。徐建国等人在对桑椹籽蛋白提取中，得桑椹籽粕研碎，经加盐液、浸提、过滤、蛋白质提取液、盐析、离心沉淀蛋白、冷冻干澡后得蛋白粉末。

2.3基于电荷不同的分离技术

2.3.1离子交换层析技术

在实际处理期间，还要根据电荷的性质，合理选择离析方式，筛选最佳的离析方式，以此提升处理工作效果。在此期间，層析介质是可以选择的，分为阳离子层析和阴离子层析，选择合适的层析介质条件，有利于提升分离效果，以阴离子为介质做交换层析为例，葡聚糖颗粒本身携带正电荷，吸附环境中带负电的蛋白质阴离子，此时用带有不同浓度的负电离子（如Cl-）溶液进行洗柱。洗脱液中的阴离子会取代蛋白质分子。低盐浓度时带电少的蛋白质结合力弱被优先洗涤下来，随着洗脱溶液中阴离子浓度的不断提高，带电量多的结合紧的蛋白质也不断地被先后洗脱下来。若用酸碱程度不同的缓冲液进行洗柱，随着层析柱内溶液PH的变化，距离其等电点近的蛋白质由于不带电荷而被洗脱下来。这样，利用离子交换层析，便将在洗脱过程中带电程度不同的蛋白质分离开来了。

2.3.2电泳技术

电泳技术越来越用在食品、环保、工业等各个领域，也是分离纯化蛋白质的手段之一。用于蛋白质分离的电泳技术是根据蛋白质分子所带电荷和荷质比差异进行分离的，离子在给定的电场中运动，一段时间后，不同的离子会由于移动速率的不同在电场中拉开距离，移动方向与离子本身所带电荷相反，即在电场中运动方向相反，可以根据距离的不同以及与介质的不同等达到分离的目的。

3未来发展趋势与总结

由于蛋白质特性具有许多不同于其他无机分子，及其他小分子有机物的性质，如：物理化学性质的易改变，本身带有其他配体、辅基离子等特殊的因子，结构功能也复杂，从而会使得的分离提取出的蛋白结晶过程增加难度。我们回首之前的科学探索，发现多数的结果会具有一定的限制性，能只适用所用的实验对象，所以到目前为止，我国还没有研究单一的适合所有蛋白都能提取出来的手段，同样不能利用合理的措施将纯度与分离效果达到最大值，还需要利用物理与化学结合方式对其分离处理，在多种方法共同起作用的情况下，确保蛋白质的分离纯度达到所需要求，全面优化技术手段，满足现代发展方面的需求，提升分离水平。

参考文献：

[1]Wan Y H，Lu J R，Cui Z F.Separation of lysozyme from chicken egg white using ultrafiltration[J].Sep Purif Technol，2016，48（2）：133-142.

[2]姜燕蓉，张亚飞，齐筱莹，等.等电点沉淀法提取牡蛎蛋白及其蛋白组成分析[J.渔业研究，2019，41（2）：106-112.

[3]王伟，刘俊荣，马永生，等.等电点沉淀法鱼分离蛋白结构与功能变化研究进展[J].食品科学，2019，36（1）：250-255.

[4]徐建国，胡青平，王向东等.超滤法分离干酪乳清中蛋白质的研究[J]中国粮油学报2019，24（6）

[5]崔晓蓬，杨海朋，徐国霞，等.用离子交换层析技术提取发酵液中丙酸[J].过程工程学报，2016，16（3）：407-412.

课题：

北京青少年拔尖人才培养计划，科学课题开题阶段联合培养实施方案

（2020年2-4月），学科名称：生命科学，培养实验室名称：清华大学饶子和实验室（蛋白质科学国家重点实验室），导师姓名：饶子和，职称或职务：教授博士生导师，培养学生姓名及年级：刘奕飞，基地中学：北京师范大学附属实验中学，指导教师：李晓辉，职称或职务：特级教师，北京青少年科技中心北京青少年科技教育协会，二零二零年。

第二作者：李明宇清华大学医学院基础医学系

（作者单位：北京师范大学附属实验中学）