12种百合杂交类型香气成分比较

王 婷 张浩宇 刘芝芝 樊玮鑫 杜 方*

(1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801； 2. 山西农业大学 实验教学中心，山西 太谷 030801)

花香是植物的重要特征，一方面植物通过花器官释放挥发性成分保障授粉和结实，另一方面花香特征被植物用来吸引天敌和免受侵害[1-2]。同时，花香能扩展植物的观赏性，对观赏植物的观赏价值和经济效益具有重要意义。百合是世界上著名的球根花卉，栽培范围覆盖亚洲、北美洲和欧洲，可应用于切花、盆栽和园林绿化、食品和日化等多个领域，百合的花香类型是人们选购和应用时考虑的重要因素[3]。全世界约有百合野生植物100多种，品种近10 000个[4]，各品种花香特征差异较大，是研究花香性状的优良材料。

花香成分微量、复杂，研究具有一定困难。近年来随着分析技术的发展，植物花香研究逐渐增多，有关学者分别对玫瑰[5- 6]、芍药[7]、桂花[8]、晚香玉[9]、杭白菊[10]和百合[3, 11]的花香进行了研究，并取得了一些进展。花香成分由多种易挥发的小分子化合物组成[12-13]，主要类群有萜烯类、苯类和脂肪酸衍生物[14-15]。百合花被片是主要的释香部位[16-17]。与无香百合相比，单萜类化合物是有香百合花香挥发物的关键成分，其中桉树脑、罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯含量较高[11]。虽然各个品种的花中具有很多相同的香气物质，但多种挥发性成分不同比例地组合、相互作用，使得百合花香具有丰富的类型。随着育种技术的不断发展，市场上出现了越来越多的百合杂交类型，它们形态各异，花香丰富。然而，百合的花香性状遗传规律尚不明确，系统性地对百合杂交类型进行花香成分分析和遗传规律研究较少。

本研究选择了12种百合杂交类型共41个品种的花被片作为试验材料，采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术检测每个品种花被片的挥发性成分与释放量，并对其进行深入分析、归纳，旨在研究百合的香气成分以及百合杂交类型之间香气成分的关系，以期为百合香气应用、培育新香型百合育种提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验选用的41种百合，露地种植于山西农业大学园艺站，包括亚洲百合(A)、亚喇百合(AT)、麝香百合(L)、麝亚百合(LA)、麝东百合(LO)、 豹纹百合(LP)、头巾百合(M)、东方百合(O)、东喇百合(OT)、喇叭百合(T)、喇亚百合(TA)和喇东百合(TO)，材料名录见表1。选择晴朗天的8：00—10：00 采集各品种处于盛开期(花被片完全展开，花药开始散粉)且生长势一致的健康植株的花被片用于挥发性成分测定，取3朵花作为一个样品，重复测定3次。

1.2 试验仪器

气相色谱质谱联用仪(GC-MS)型号为Trace ISQ，色谱柱型号为DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，均产自美国Thermo Fisher 公司；顶空固相微萃取装置(50/30 μm PDMS/DVB/CAR)(萃取头及进样器产自美国Supelco 公司)。

1.3 试验试剂

标准品3-庚酮(3-Heptanone)购自德国Dr.Ehrensorfer公司。

1.4 顶空固相微萃取

称取各品种花被片约1.5 g 置于15 mL固相微萃取专用顶空瓶中，加入3-庚酮作为内标，试验重复3次。用已老化好的萃取头(Supelco公司，50/30 μm PDMS/DVB/CAR)50 ℃顶空萃取15 min。自动进样，在进样口解析5 min。

1.5 GC-MS分析

GC(Gas Chromatography)工作条件：色谱柱型号为DB-5MS。载气为He，流速为1 mL/min。程序升温过程：起始温度40 ℃，保持2 min，然后以 5 ℃/min 的速度升至270 ℃，保持6 min。

MS(Mass Spectrometry)工作条件：电离方式为 El；电离电压为 70 eV；质谱扫描为45～600 amu；离子源温度为 280 ℃；接口温度为 280 ℃。

采用 Xcalibur 软件系统，使用 NIST 谱库检索兼顾色谱保留时间确认和筛选对花朵挥发性成分进行定性分析。各化合物成分绝对含量/(ng/g)=(挥发性化合物峰面积/内标化合物峰面积×内标化合物含量)样品质量[6]。

1.6 数据分析

使用HemI 1.0[18]创建热图分析比较样品挥发性成分；使用PAST 3.0[19]创建非度量多维尺度图比较样品挥发性成分变异模式；利用InteractiVenn工具[20]建立韦恩图分析样品挥发性成分数目差异。

2 结果与分析

2.1 41种百合香气成分和组成分析

从12种百合杂交类型41个百合品种的盛花期花被片的顶空挥发物中共检测到47种成分(图1)，各品种中检测到的挥发性成分的数目和种类各不相同，9种(AT1)～35种(T5)不等。将挥发性成分按生化合成途径分类。挥发性成分的主要类群为单萜类化合物(1.44%～92.90%)、苯类化合物(1.92%～84.62%)和脂肪酸衍生物(0.35%～69.44%)。在百合的挥发物中检测到了很多种成分，但其中绝大部分成分的相对含量很低(图1)，而相对含量最高的成分为3种单萜类(桉树脑、芳樟醇、(E)-β-罗勒烯)和一种酯类(苯甲酸甲酯)。研究发现，即使各品种所含挥发性成分的数量和质量各不相同，属于同一杂交类型的百合品种间的相似性往往较高。

亚洲百合：在5种亚洲百合中共检测到34种挥发性成分，共有成分有17种。苯甲酸甲酯(7.06%～39.63%)是共同的主要成分(相对含量>10%)，一些品种还含有高水平的芳樟醇(A27和A39)、桉树脑(A21和A38)、β-石竹烯(A39)、己酸甲酯(A38)和辛酸甲酯(A38)。

表1 试验所用植物材料名录Table 1 List of plant materials used for researching

EDMC=2-Ethenyl-1,1-dimethyl-3-methylenecyclohexanea
图1 41种百合挥发性成分分布热图
Fig.1 Heat map of scent profiles released from 41 volatile-emitting lilies

亚喇百合：从5种亚喇百合中共检测到26种挥发性成分，共有成分有7种。总的来说，苯甲酸甲酯(5.95%～26.95%)、2-甲基丁酸甲酯(11.82%～17.35%)、萘(4.01%～15.11%)和辛酸甲酯(1.62%～15.16%)是亚喇百合的主要花香成分。在AT1和AT2中还检测到高水平的桉树脑(43.34%，11.93%)。同时，癸烷(2.29%～4.47%)和癸醛(0.35%～1.33%)是亚喇百合的次要组成成分(1%<相对含量<10%)。

麝香百合：在麝香百合中检测到32种挥发性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(30.19%)、芳樟醇(16.12%)、苯甲酸乙酯(14.40%)和2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亚甲基环己烷(12.11%)。

麝亚百合：在5种麝亚百合中共检测到36种挥发性成分，共有成分有12种。苯甲酸甲酯(15.51%～82.22%)、芳樟醇(1.72%～33.67%)、(E)-β-罗勒烯(1.91%～32.40%)和2-甲基丁酸甲酯(1.04%～11.04%)是这5种麝亚百合的主要释放成分。其他成分，包括月桂烯(0.54%～4.75%)、(Z)-β-罗勒烯(0.21%～3.87%)、己酸甲酯(0.19%～4.68%)和萘(0.22%～1.12%)是次要释放成分。

麝东百合：在5种麝东百合中共检测到38种挥发性成分，共有成分有14种。主要成分是苯甲酸甲酯(18.00%～41.88%)、2-甲基丁酸甲酯(0.64%～24.20%)和(E)-β-罗勒烯(1.09%～10.67%)。苯甲酸乙酯(0.14%～9.84%)、月桂烯(0.21%～3.63%)、己酸甲酯(0.15%～3.25%)和(Z)-β-罗勒烯(0.49%～1.64%)是次要释放成分。同时，芳樟醇(23.77%～59.28%)也是LO2、LO3和LO4的主要成分，这3种百合的主要挥发性成分与麝亚百合相似。

豹纹百合：在豹纹百合LP1中检测到31种挥发性成分。(E)-β-罗勒烯(25.99%)和己酸甲酯(11.02%)是LP1的主要释放成分。

头巾百合：在头巾百合M1中检测到22种挥发性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(18.00%)、β-石竹烯(14.58%)和己酸甲酯(11.59%)。

东方百合：2种东方百合的释放组成较为相似，在这2种百合中检测到的34种成分中有20种共有成分。苯甲酸甲酯(25.59%～38.48%)、(E)-β-罗勒烯(18.50%～22.44%)和月桂烯(12.01%～14.67%)是东方百合的主要成分。次要成分是苯甲酸乙酯(0.28%～8.42%)、芳樟醇(4.43%～6.43%)、(Z)-β-罗勒烯(2.05%～3.97%)、(E,Z)-别罗勒烯(2.13%～3.58%)、2-甲基丁酸甲酯(2.12%～3.38%)、丁酸甲酯(0.16%～1.32%)和γ-松油烯(0.60%～1.06%)。

东喇百合：在6种东喇百合中共检测到40种挥发性成分，共有成分有17种。这6种百合的挥发性成分差异较大，苯甲酸甲酯(30.71%～47.93%)、(E)-β-罗勒烯(2.45%～20.82%)和2-甲基丁酸甲酯(1.59%～18.50%)是它们共同的主要成分。此外，芳樟醇在OT6、OT35、OT37和OT39中相对含量较高(9.20%～23.32%)，桉树脑在除OT39外的5个品种中相对含量较高(5.45%～17.99%)。

喇叭百合：在5种喇叭百合中共检测到36种挥发性成分，共有成分有15种。苯甲酸甲酯(9.71%～68.46%)、桉树脑(20.67%～60.08%)和α-蒎烯(2.97%～11.37%)是喇叭百合的主要成分。苯甲酸甲酯在除T2外的所有喇叭百合中都含量极高(34.12%～68.46%),而T2释放出高水平的桉树脑(60.08%)和α-蒎烯(11.37%)。包括α-萜品醇(0.35%～7.87%)、4-萜品醇(0.08%～7.31%)、(E)-β-罗勒烯(0.08%～6.40%)、水杨酸甲酯(0.39%～3.13%)、月桂烯(0.54%～2.91%)、萜品油烯(0.16%～2.61%)、γ-松油烯(0.45%～2.55%)、和β-蒎烯(0.27%～1.80%)在内的其他化合物是喇叭百合的次要挥发性成分。

喇亚百合：在喇亚百合TA1中检测到28种挥发性成分。主要成分是苯甲酸甲酯(38.66%)和桉树脑(30.52%)。

喇东百合：4种喇东百合的释放组成较为相似，在这4种百合中检测到的31种成分中有21种共有成分。桉树脑(41.25%～64.32%)和α-蒎烯(4.45%～14.18%)是喇东百合的主要成分。同时，4-萜品醇(1.55%～9.28%)、苯甲酸甲酯(0.51%～7.18%)、β-侧柏烯(1.50%～6.53%)、2-甲基丁酸甲酯(0.49%～5.18%)、γ-松油烯(2.88%～4.73%)、萘(0.63%～4.41%)、桧烯(1.82%～3.77%)、邻伞花烃(1.18%～3.33%)、月桂烯(1.10%～2.93%)、甲苯(0.47%～2.92%)、β-石竹烯(0.18%～2.85%)、对二甲苯(0.31%～2.08%)、β-蒎烯(0.59%～1.34%)、α-法尼烯(0.07%～1.33%)、(E)-β-罗勒烯(0.24%～1.15%)和癸烷(0.32%～1.06%)是喇东百合的次要挥发性成分。

2.2 41种百合香气释放水平比较

对各品种百合香气释放水平进行比较，发现各品种释放水平差异极大(图2)。麝香百合L1的释放水平最高，达到23 598.60 ng/g，而亚洲百合AT1的释放量仅有54.95 ng/g。即使同种杂交类型之间的品种也存在差异，杂交类型之间的差异更为明显。麝香百合的释放水平最高，其次是麝东百合(4 801.74～21 188.20 ng/g)和东喇百合(6 011.12～22 226.40 ng/g)，喇叭百合(1 232.89～13 349.04 ng/g)和东方百合(6 071.81～10 163.10 ng/g)，豹纹百合(4 565.00 ng/g)，喇东百合(1 796.78～4 093.16 ng/g)，头巾百合(1 963.38 ng/g)和喇亚百合(1 488.01 ng/g)，亚洲百合和亚喇百合的香气释放水平最低，仅有 54.94～1 414.24 ng/g。

图2 41种百合香气释放水平比较
Fig.2 Comparison of volatile emission levels released from 41 lilies

2.3 12种百合杂交类型香气组成成分差异

根据百合各品种的挥发性组成成分及其相对含量进行非度量多维度尺度分析(图3)，发现各品种按照杂交类型或紧密或松散地聚在一起。麝香百合、麝东百合、麝亚百合和东方百合的位置比较接近，它们较其他类型百合释放出更高比例的芳樟醇和(E)-β-罗勒烯。喇东百合和喇叭百合释放的桉树脑水平较高，芳樟醇和(E)-β-罗勒烯的水平低，因此和其他百合的距离较远。东喇百合释放的桉树脑水平较喇东百合和喇叭百合低，释放的芳樟醇和(E)-β-罗勒烯的水平较高，处于这几种百合的中间位置。亚洲百合、亚喇百合和头巾百合的位置较为接近。

选择布雷柯蒂斯分析方法，胁强系数=0.18。
Using Bray-Curtis similarity, stress=0.18.
图3 非度量多维尺度图
Fig.3 Non-metric multidimensional scaling plot

2.4 香气性状的关系

由杂交种再次相互杂交得到的混杂交类型结合了亲本的香气性状，用韦恩图比较混杂交类型与亲本杂交类型释放的香气组分(图4)，发现东喇百合和喇东百合释放的化合物在它们的亲本杂交类型中也存在。麝亚百合、亚喇百合、喇亚百合中也存在这种现象，此外，还存在几种在亲本杂交类型中未检测到的特殊化合物(1～3种)，可能是因为未选择到这几种混杂交类型的真正亲本。将各混杂交类型4种主要挥发性成分[桉树脑、(E)-β-罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯]的相对含量分别与亲本杂交类型进行对比(图5)，也发现亚喇百合和喇亚百合(图5(a))、东喇百合和喇东百合(图5(c))结合了亲本的香气特征。与不香的亚洲百合不同，麝亚百合挥发的桉树脑的相对含量很低(图5(b))，它们更多地遗传了麝香百合亲本的香气特征，并且总香气挥发水平处于麝香百合和亚洲百合中间(图2)。麝东百合相较亲本释放出更高水平的芳樟醇(图5(d))，原因可能是我们选择的两种东方百合的芳樟醇含量均较低，与麝东百合真正亲本材料的释放量存在差异。

(a)亚洲百合、喇叭百合、亚喇百合和喇亚百合的共有化合物；(b)亚洲百合、麝香百合和麝亚百合的共有化合物；(c)东方百合、麝香百合和麝东百合的共有化合物；(d)东方百合、喇叭百合、东喇百合和喇东百合的共有化合物。(a) The shared compounds of Asiatic hybrids， Trumpet hybrids， Asiatic×Trumpet hybrids and Trumpet×Asiatic hybrids; (b) The shared compounds of Asiatic hybrids, Longiflorum hybrids and Longiflorm×Asiatic hybrids; (c) The shared compounds of Oriental hybrids, Longiflorum hybrids and Longiflorm×Oriental hybrids; (d) The shared compounds of Oriental hybrids, Trumpet hybrids， Oriental×Trumpet hybrids and Trumpet×Oriental hybrids.
图4 不同杂交类型香气成分个数比较
Fig.4 Comparison of aroma components among different lily hybrid groups

3 讨论与结论

不同杂交类型百合香气差异较大，这种差异与花朵的挥发性成分有关，其香气类型差异主要体现在香气成分种类差异、品种特有香气成分以及品种间香气成分的含量差异中。花被片是花朵的主要释香部位[16-17]，通过研究41种百合花被片挥发性物质的种类和含量发现，百合花被片的香气成分主要是单萜类和苯环类物质，花朵呈现的香味主要是这些物质共同作用的结果。无香的亚洲百合和亚喇百合释放的挥发性成分的种类和释放量都显著低于其他类型百合，主要成分是苯甲酸甲酯。Kong等[11]在亚洲百合‘Benfica’‘Nello’‘Navona’‘Pollyanna’和‘Renoir’的花被片中并未检测到挥发性成分，但在亚洲百合‘穿梭’中检测到桉树脑、(E)-β-罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯等成分[16]，这些差异可能由试验材料和收集香气方法不同所致。麝香百合‘白天堂’的主要成分是苯甲酸甲酯、芳樟醇、苯甲酸乙酯和2-乙烯基-1,1-二甲基-3-亚甲基环己烷，这与Kong等[11,16]在‘白天堂’和其他2种麝香百合检测的结果不同，推测栽培条件可能影响百合香气释放。豹纹百合的主要释放成分是(E)-β-罗勒烯和己酸甲酯，头巾百合的主要成分是苯甲酸甲酯、β-石竹烯和己酸甲酯，这是第一次检测到这两种类型百合的香气成分。东喇百合和喇东百合主要香气成分有很大差异，东喇百合的主要成分是苯甲酸甲酯、(E)-β-罗勒烯和2-甲基丁酸甲酯，桉树脑和α-蒎烯是喇东百合的主要成分。总体而言，桉树脑、(E)-β-罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯的释放量较高，推测是百合香气的主要来源，此结果与 Kong等[11]、张辉秀等[3]、Hu等[21]从不同品种百合挥发物的成分所检测的结果近一致。

(a)亚洲百合和喇叭百合(左)、亚喇百合和喇亚百合的分布(右)。(b)亚洲百合和麝香百合(左)、麝亚百合的分布(右)。(c)麝香百合和东方百合(左)、麝东百合的分布(右)。(d)东方百合和喇叭百合(左)、东喇百合和喇东百合的分布(右)。(a) Distribution of Asiatic and Trumpet hybrids (left), Asiatic×Trumpet and Trumpet×Asiatic hybrids (right). (b) Distribution of Longiflorum and Asiatic hybrids (left), Longiflorm×Asiatic hybrids (right). (c) Distribution of Longiflorum and Oriental hybrids (left), Longiflorm×Oriental hybrids (right). (d) Distribution of Oriental and Trumpet hybrids (left), Oriental×Trumpet and Trumpet×Oriental hybrids (right).
图5 不同杂交类型4种主要成分[桉树脑、(E)-β-罗勒烯、芳樟醇和苯甲酸甲酯]组成雷达图
Fig.5 Rader maps of different lily hybrid groups based of compositions of four major volatiles [eucalyptol,(E)-β-ocimene, linalool and methyl benzoate]

所有杂交种的表型性状都可以追溯到它的亲本[22]，与其他遗传性状一样，花朵的挥发性成分也可以反映植物的遗传规律[23]。亚洲百合的亲本大部分为无香(毛百合、卷丹和川百合)或香味很淡(朝鲜百合和垂花百合)[24]，这些亲本可能把这种香味特征传递给了它们的杂交种。喇叭百合的香气特征可能来源于包括通江百合、淡黄花百合和王百合等有香百合以及无香百合湖北百合[11]。亚喇百合几乎闻不到香味，推测它们的香气特征更多地来源于亚洲百合亲本。麝香百合香气释放强度很高，麝亚百合结合了麝香百合和亚洲百合的香气特征，释放强度介于两者之间。东方百合香气浓重芬芳，亲本是有香的天香百合、鹿子百合和日本百合等百合[16]。桉树脑在东喇百合和喇东百合中含量很高，这种重要花香组成成分来源于它们的亲本喇叭百合。

同一杂交类型品种的香气特征在一定程度上相似，在非度量多维尺度图中往往距离较近。杂交类型之间的差异反映了它们的遗传系谱，比较混杂交类型与亲本杂交类型释放的香气成分个数，发现由杂交种再次相互杂交得到的混杂交类型结合了亲本的香气性状。东喇百合和喇东百合都是由东方百合和喇东百合混杂而成，但是东喇百合和喇东百合无论是香气成分组成还是非度量多维尺度图中的位置都有差异，因此杂交时不同父母本的选择可能导致后代香气特征的不同。研究有助于在花香育种工作中为百合杂交亲本选择提供理论参考。