Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响

谷泽丰，曹艳飞，杨海霞，焦 钰

Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响

谷泽丰，曹艳飞，杨海霞，焦 钰

（1. 广东海洋大学水产学院 // 2. 广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东 湛江 524025）

【】研究JAK3抑制剂对珍珠囊发育及移植免疫反应的影响。以马氏珠母贝（）为材料，植核前用JAK3抑制剂处理细胞小片和珠核，植核后18 d和30 d取珍珠囊，用石蜡切片技术和H.E.染色法（Hematoxylin-eosin Staining）观察JAK3抑制剂对珍珠囊发育的影响，利用荧光定量技术检测植核后不同时间（6、12、24 h和3、6、12、18、30 d）免疫相关基因NF-kappaB（Nuclear factor kappa B）、IkappaK（I-kappaB kinase）和炎性诱导因子IL-17（Interleukin 17）的表达变化。植核后18 d和30 d，与对照组相比，JAK3抑制剂对珍珠囊的发育没有显著影响(> 0.05)。荧光定量结果显示，植核后6 h和12 h，JAK3抑制剂可以显著性抑制IL-17的表达，植核后6、3、6、12 d，JAK3抑制剂可以显著性抑制NF-kappaB的表达，植核后3、6 d，JAK3抑制剂可以显著性抑制IkappaK的表达(< 0.05)。JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有明显的抑制作用，可以有效调控珍珠贝植核后的移植免疫，而对珍珠囊发育的影响不明显。

马氏珠母贝；珍珠囊；移植免疫；Janus激酶3抑制剂

目前，海水珍珠养殖所用的主要珍珠贝是马氏珠母贝，又称为合浦珠母贝，其所产珍珠总量占全国总产量95%以上[1-2]。在人工珍珠养殖过程中，需要向育珠贝中植入1个供体贝的外套膜细胞小片组织和1个圆形的珠核[3]，由于植入细胞小片与珠核为外来物，育珠贝在接受植核手术后会发生移植免疫，并引发一系列的免疫应答。有效的免疫应答可以帮助贝体及时清除抗原性异物，保护机体不受到侵害[4]，但过强的免疫反应会导致贝体吐核甚至是死亡，严重影响珍珠的质量和产量。因此，植核诱导的免疫反应会对珍珠的形成发挥关键作用，它的程度将会直接影响珍珠的质量和产量。

JAK（Janus kinase）蛋白家族参与组成了动物体重要的免疫信号传导途径—JAK-STAT（Signal transducer and activator of transcription）通路，对机体的免疫应答具有重要调控作用[5]，这个信号通路的发现让研究人员对细胞因子作用和基因调控有更为深入的认知[6]。目前，已发现JAK蛋白家族主要分为4个亚型：JAK1、JAK2、JAK3、TyK2。其中，JAK3可以被多种细胞因子激活，赋予细胞多种生理功能，且能够激活基因，引发一系列免疫相关基因的连锁表达[7]。而JAK3抑制剂作为本世纪发明应用的新型免疫疾病治疗药物[8]，可以有效抑制和调节JAK3蛋白，并且抑制由细胞信号因子和细胞因子共同作用而引发的基因表达，从而达到抑制移植免疫反应的作用[9]。

本研究以养殖的马氏珠母贝为实验材料，利用石蜡切片技术（Paraffin Section Technology）、H.E.染色法（Hematoxylin-eosin Staining）以及荧光定量法分析JAK3抑制剂对马氏珠母贝植核育珠后珍珠囊的发育，以及免疫相关基因的表达情况，为有效调控珍珠贝移植排斥反应提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验贝材料

马氏珠母贝取自广东省湛江市徐闻养殖基地，规格统一且贝龄为2 龄，利用人工插核技术进行植核后珍珠贝培育工作。植核实验分为2组：一组是正常植核过程的马氏珠母贝，为对照组；另一组是实验组，首先利用JAK3抑制剂处理细胞小片和珠核，然后将处理过的细胞小片和珠核植入马氏珠母贝。

1.2 珍珠囊组织切片的制备

分别在植核手术后18 d和30 d，对照组与JAK3抑制剂处理组各取插核贝5只，分别分离珍珠囊组织，用苦味酸进行预固定，再在青霉素小瓶中将材料继续固定一夜。将固定好的材料用不同浓度梯度的乙醇溶液逐步脱水洗涤，再用二甲苯溶液将材料透明。将脱水透明后的材料浸蜡并进行包埋，再将包埋后的大蜡块进行切割修整并用切片机进行切片贴片。将切片用二甲苯溶液、二甲苯与乙醇混合溶液以及不同浓度梯度的乙醇溶液进行脱蜡复水并用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin Staining）对玻片进行染色。用中性树胶对切片封藏，通过Leica MD6000B型生物显微镜观察制作好的珍珠囊组织切片，再通过Laica DFC500数码显微镜拍照系统进行观察、拍照记录。

1.3 荧光定量PCR的测定

用于实时荧光定量PCR检测的材料取自马氏珠母贝的血细胞。分别在植核手术后6、12、24 h和3、6、12、18、30 d抽取并离心分离，得到血细胞，再使用Trizol 法进行提取总RNA。模板cDNA的获得参照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H）说明书进行，反转录合成得到植核后马氏珠母贝各个时间的cDNA。

将上述反转得到cDNA产物作为模板，以β-actin为荧光定量内参基因进行实时荧光定量PCR。运用2-△△CT[10]法分析计算血细胞相对表达量，运用SPSS 22.0对实验数据进行单因素方差分析，并用Duncan’s多重比较对均值进行差异显著性检验，显著性水平= 0.05。

表1 荧光定量PCR所用引物序列

qRT-PCR反应程序：95 ℃预变性 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

2 结果与分析

2.1 JAK3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊的影响

植核后18 d和30 d，对照组与JAK3抑制剂处理组各取10只插核贝，分离珍珠囊组织，统计珠囊成囊率。在植核后18 d，对照组和JAK3抑制剂处理组的马氏珠母贝珍珠囊的成囊率均为80%，在植核后30 d，对照组和JAK3抑制剂处理组的马氏珠母贝珍珠囊的成囊率均为100%结果说明，JAK3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊成囊率没有影响。

有研究表明，在珍珠囊发育过程中，其表皮细胞形态会经历一个由扁平-柱状-扁平的形态转变过程[17]。在植核后30 d，一般处于前期的扁形，或者柱形细胞。珍珠囊表皮细胞形态变化观察结果见图1。

A：对照组18 d珍珠囊，表皮细胞为扁平细胞；B：JAK3抑制剂处理组18 d珍珠囊，表皮细胞由扁平细胞向柱状细胞过度；C：JAK3抑制剂处理组18天珍珠囊，表皮细胞为柱状细胞；D：对照组30 d珍珠囊，表皮细胞为柱状细胞; : 扁平细胞； : 柱状细胞。

植核后18 d，对照组样本中4个囊内表皮细胞为扁平细胞，1个为柱状细胞；JAK3抑制剂处理组2个囊内表皮细胞为扁平细胞，3个为柱状细胞。植核后30 d，对照组样本中3个囊内表皮细胞为扁平细胞，2个为柱状细胞；JAK3抑制剂处理组中2个囊内表皮细胞为扁平细胞，3个为柱状细胞（图1）。这些数据说明JAK3抑制剂可能对马氏珠母贝珍珠囊表皮细胞组织形态变化有少量的促进作用，但仍需大量样本的验证。

2.2 JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫相关基因表达的影响

荧光定量结果显示，与对照组相比，在植核后6 h，12 h，JAK3抑制剂可以显著性抑制炎性因子IL-17的表达；在植核后6 h，3 d，6 d和12 d，JAK3抑制剂可以显著性抑制NF-kappaB的表达；在植核后3 d和6 d，JAK3抑制剂可以显著性抑制IkappaK的表达。这些结果表明，JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有着明显的抑制作用（图2）。

柱子上不相同小写字母表示基因表达在JAK3抑制剂处理组和对照组间有显著性差异（< 0.05）

The different lowercase letters on the adjacent columns indicated that the gene expression have significant difference between JAK3 inhibitor treated group and the control goup (< 0.05)

图2 JAK3抑制剂对免疫相关基因表达的影响

Fig. 2 The relative expression of genes at different time in the two groups

3 讨论

Janus激酶是一种细胞质酪氨酸激酶，普遍存在于哺乳动物细胞胞质中，目前已发现JAK1、JAK2、JAK3和TyK2等4个亚型[7]。其中JAK1、JAK2和TyK2亚型在动物体组织细胞中均有分布，而JAK3则特异性地分布在动物体的骨髓和淋巴细胞中，并在活化的T细胞、B细胞和单核细胞中高度表达，所以JAK3抑制剂不仅能有效抑制机体的免疫反应，还没有毒副作用[11]。黄堃[12]研究表明，JAK蛋白家族在参与哺乳动物细胞免疫中可以作为干扰素受体或细胞因子受体的效应分子向细胞内传达免疫信号，JAK催化受体上的酪氨酸受体与周围的氨基酸序列产生“停泊位点”，然后招募STAT蛋白到这个“停泊位点”与之形成JAK-STAT通路，STAT蛋白形成二聚体入核，结合DNA调控分子转录，激活基因进行转录。JAK3抑制剂可以有效抑制JAK-STAT通路形成，抑制细胞因子表达，从而抑制机体的免疫反应。贝类的免疫作用是一种非特异性的低等免疫反应，可以分为细胞免疫与体液免疫等2种方式。袁万安等[13]研究表明，育珠蚌在植核后由于受到植入细胞小片和珠核所需手术的损伤，以及植核中因操作不当而造成的外物侵入，这一系列外界刺激会激活育珠蚌的免疫系统，促使蚌内的多能干细胞活化并增殖，分化形成3种免疫细胞：巨嗜细胞、嗜碱性颗粒细胞和嗜酸性颗粒细胞，3种免疫细胞再会通过吞噬作用和炎症反应等来达到免疫的目的。刘世良等[14]认为贝类中的体液免疫是由血细胞分泌大量的体液因子到血浆中发挥防御作用，所以在贝类中，细胞免疫与体液免疫是密不可分的。而在贝类中已经发现有类白细胞介素IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-6、TNF-a等细胞因子的存在，并且具备有高等动物中的类似功能。本课题组之前发现马氏珠母贝中存在炎性因子IL-17，参与调控贝类免疫反应。

Huang等[15]发现珍珠贝IL-17可以活化靶基因中NF-kappaB的结合位点，参与并激活NF-kappaB信号通路的产生。而NF-kappaB是由Sen等[16]首次发现的，他们是在B淋巴细胞中发现了一种能与免疫球蛋白kappa轻链基因增强子B位点特异结合的核蛋白因子，他们称之为核因子kappaB。NF-kappaB是一种在真核生物中比较保守的转录因子家族，它几乎在所有细胞和组织中都有表达，并由这一类家族成员形成的同源或异源二聚体，结合在含有NF-kappaB结合位点的基因启动子或增强子上，形成NF-kappaB信号通路。NF-kappaB信号通路能够快速调节基因的表达，从而达到调节细胞、组织、器官和有机体正常生理活动与生命周期的作用。所以，当NF-kappaB信号通路被抑制时，炎症因子的表达以及机体的免疫反应就能得到很好控制，从而有效控制移植免疫，提高移植成功率。NF-kappaB信号通路中有1个至关重要的中枢分子就是IkappaK复合物，它在整个NF-kappaB形成过程中起重要承接作用。当外界传达来刺激时，活化信号会先传送到IkappaK复合物，随后被活化的IkappaK复合物再去激活NF-kappaB，从而完成整个信号通路过程[17]。所以NF-kappaB、IkappaK和IL-17之间具有密切联系，共同协作激活机体免疫反应，三者的表达情况共同反应出机体免疫反应的情况。我们课题组前期研究[18]表明，植核手术可以诱导IL-17、NF-kappaB和IkappaK的表达，说明植核手术诱导了珍珠贝的免疫反应，但JAK3抑制剂可以显著性抑制植核手术诱导的IL-17、NF-kappaB和IkappaK的表达，说明JAK3抑制剂可以有效调控珍珠贝植核后的移植免疫。

通过对珍珠囊形成率和显微结构的分析发现，JAK3抑制剂对珍珠囊的形成率没有显著影响，但对珍珠囊表皮细胞的形态转变具有一定促进作用。已有研究表明，珍珠囊表皮细胞是由植入的细胞小片外表皮细胞逐渐迁移到珠核周围再经过增殖形成的，在不同时期的细胞形态也有所不同。在植核后15 ~ 20 d时先形成扁平状细胞，在植核后20 ~ 30 d时由扁平状向高柱状细胞转变，在插核后 60 d时柱状细胞又转变成扁平状细胞并具有稳定分泌功能。早期的扁平状细胞没有分泌功能，而柱状细胞分泌物对棱柱层和壳皮层的形成具有重要作用，在后期的扁平细胞时才能分泌珍珠质，形成珍珠层[19]。JAK3抑制剂对珍珠囊表皮细胞由早期扁平细胞向柱状细胞转变具有一定促进作用，这可能会促进珍珠质形成，增加珍珠质量。

综上，JAK3抑制剂对马氏珠母贝免疫基因表达有着明显抑制作用，而对珍珠囊发育的影响不明显。因此，JAK3抑制剂可以有效调控珍珠贝的移植免疫，可以应用于珍珠生产。

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Effect of Janus Kinase 3 Inhibitor on the Development of Pearl Sac and the Expression of Immune-related Genes in Pearl Oyster

GU Ze-feng, CAO Yan-fei, YANG Hai-xia, JIAO Yu

（1.// 2.,524088,）

Excessive immune response in pearl oyster after nucleus-grafting surgery could affect the development of pearl sac, leading to a decline in the quality and quantity of pearls. Our previous research showed that Janus kinase 3 inhibitor (JAK3 inhibitor) could reduce the mortality after nucleus-grafting surgery. In this research, we detectedthe effect of JAK3 inhibitors on pearl sac development and immune response after grafting.We pre-treated the mantle piece and pearl nuclei with JAK3 inhibitors before grafting surgery in pearl oyster, and observed the development of pearl sac formation through paraffin section technology and H.E standing, and detected the immune related genes by fluorescence quantitative detection technology (qRT-PCR) after grafting.JAK3 inhibitors have no significant effect on the development of pearl sacs compared with the control group at 18 d and 30 d after the grafting. The result of qRT-PCR showed that JAK3 inhibitors could significantly down-regulated NF-kappaB expression at 6 h, 3 d, 6 d and 12 d after grafting, and reduced the expression of IkappaK at 3 d and 6 d, and inhibited the proinflammatory cytokine IL-17 expression at 6 h and 12 h.JAK3 inhibitor treatment can effectively inhibit immune response after grafting in pearl oyster.

; pearl sac; transplantation immunology;inhibitor of Janus kinase3

S917.4

A

1673-9159（2020）02-0001-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.001

2019-10-23

国家自然科学基金（31672626）

谷泽丰（1997－）, 男，硕士研究生，研究方向为珍珠培育与加工。Email:83623566@qq.com

焦钰（1981－）, 女, 博士, 教授。E-mail: Gaoyang@126.com

谷泽丰，曹艳飞，杨海霞，等. Janus激酶3抑制剂对马氏珠母贝珍珠囊发育和免疫相关基因表达的影响[J].广东海洋大学学报，2020，40（2）：1-6.

（责任编辑：刘岭）