夹竹桃叶内生真菌Colletotrichum sp.HK-08的次生代谢产物及其活性研究

郑 浩，梅文莉，蔡彩虹，盖翠娟，戴好富，谭志琼，陈惠琴*

1海南大学生命科学与药学院，海口 570228；2海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101

植物内生真菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖在植物体内，而对植物没有明显负面影响的一类真菌[1]。有研究表明，大部分植物体内都含有1种或多种内生真菌[2]，随着自然界长期的进化选择，真菌与宿主之间形成了动态平衡关系。在宿主的生长周期中，内生真菌在一定程度上具有促进植物生长[3]，提高宿主植物的抗病虫害[4]，以及抵御环境压力的作用[5]。另外据报道，内生真菌与宿主植物次生代谢产物的累积也有着密不可分的关系[6]。

夹竹桃(NeriumindicumMill.)叶具有毒性但同时在治疗心脏病、心力衰竭等方面也具有较好的作用[7]。目前，关于夹竹桃叶内生真菌的研究鲜有报道，为了研究这一特殊植物体内的共生微生物，从其健康叶片中共分离鉴定了16株内生真菌，并对其次生代谢产物进行分析，其中发现菌株Colletotrichumsp.HK-08的大米发酵产物中次生代谢产物不仅化学结构丰富，而且具有较好的生物活性。通过各种色谱手段从中共分离鉴定了11个化合物，分别为butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(1)、4-hydroxyphenethyl acetate(2)、phenethyl 2-phenylacetate(3)、phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(4)、4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl)acetate(5)、4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(6)、对羟基苯甲醛(7)、2-羟基苯乙醇(8)、对羟基苯甲酸(9)、对羟基苯乙酮(10)和3a-hydroxyindoline(11)。在此基础上对分离得到的化合物进行了生物活性测试，在一定程度上丰富了Colletotrichum属真菌次生代谢产物化学结构类型和生物活性。

1 材料

1.1 菌株

真菌HK-08分离自海南省海口市海南大学校园内的健康夹竹桃叶片，现保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所，标本编号为：20180809HK-08。

1.2 仪器和试剂

旋转蒸发仪(Heidolph Laborota)，核磁共振波谱仪(Brucker AV-500，以TMS为内标)，质谱仪(Micromass Autospec-Uitima TOF)，安捷伦1260分析型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)，SUMMITP680A半制备高效液相色谱仪(戴安，美国)，ELX-800酶标仪(Bio Tex公司)，超纯水装置(厦门锐思捷水纯化技术有限公司)，超净工作台(上海博讯实业有限公司)，Sephadex LH-20(Merck公司)，C18反相材料(FU-JI公司)，柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶板(青岛海洋化工厂产品)，氘代试剂(CD3OD和CDCl3)购自Merck公司，色谱乙腈购自天津康科德公司；其他试剂均为重蒸工业试剂。

1.3 培养基

(1)PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。(2)大米固体培养基：每100 g大米加入100 mL无菌水，置于1 L三角瓶中。

2 方法

2.1 内生真菌的分离

将叶片表面清洗干净，然后依次用75%乙醇浸泡1 min，0.1%的升汞浸泡2 min，无菌水漂洗3次以进行表面灭菌。接着将叶片置于培养皿中，上下表面均与培养基相接触后取出，以此培养皿作为对照组。取出的叶片将其剪成1 cm × 1 cm的方块，贴于新的含PDA培养基的培养皿中，28 ℃恒温箱中培养3～15天。对照培养基中无真菌长出，证明表面灭菌彻底，分离得到的真菌是植物内生真菌。挑取叶片切口处长出的菌丝体，接种到新的PDA培养基上继续培养，并纯化得到单一菌株，得到的单菌落接种在PDA斜面上编号并4 ℃保存。

2.2 菌株鉴定

将真菌HK-08接种于PDA培养基，28 ℃培养7天，观察菌落的形态特征。使用试剂盒[OMEGA Fungal DNA Kit(50)]提取DNA，以ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)作为引物(上海生工生物工程股份有限公司)，对该菌株ITS序列进行测定，将测序结果提交于NCBI基因库，并与BLAST数据库进行同源比对，并利用软件MEGA X构建系统发育树。

2.3 菌株发酵

真菌在PDA培养基中活化后，挑取单个菌落接种到装有100 mL PDA液体培养基的500 mL三角瓶中，置于28 ℃，200 rpm的摇床中振荡培养2天，得到种子液，在含有大米培养基的1 L三角瓶(70瓶)中接入10 mL种子液，静置培养30天。

2.4 提取与分离

菌株发酵结束后，用乙酸乙酯萃取三遍，回收合并乙酸乙酯相，减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物(198.0 g)。将提取物用95%甲醇水溶解，以1∶1用石油醚萃取，除去石油醚层，减压浓缩得到88.0 g膏状粗提物，经过减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(100∶1～0∶1)梯度洗脱，得到15个流份(Fr.1～Fr.15)。Fr.1(2.1 g)经Sephadex LH-20 柱色谱(氯仿∶甲醇 = 1∶1为流动相)分离得到7个流份Fr.1-1～Fr.1-7。Fr.1-3经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物3(22.0 mg)。Fr.3(7.0 g)经C18反相硅胶柱色谱梯度洗脱得到10个流份Fr.3-1～Fr.3-10，其中Fr.3-5与Fr.3-6合并后经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物1(12.0 mg)、2(3.0 mg)、4(40.0 mg)。Fr.8(7.0 g)经Sephadex LH-20 柱色谱(甲醇为流动相)分离得到10个流份Fr.8-1～Fr.8-10。Fr.8-4经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物7(2.0 mg)、8(3.0 mg)、9(6.0 mg)、10(1.5 mg)。Fr.8-6(320.0 mg)经减压硅胶柱(石油醚：乙酸乙酯 = 50∶1为流动相)色谱，得到8个流份Fr.8-6-1～Fr.8-6-8，其中Fr.8-6-3经反复硅胶柱色谱分离纯化得到化合物5(2.6 mg)、6(5.0 mg)；Fr.8-6-5经半制备高效液相色谱(C18柱，乙腈-水V∶V = 21∶79为流动相，流速4 mL/min；检测波长220、245 nm)，得到化合物11(0.9 mg，tR19.0 min)。

2.5 细胞毒活性测试

采用MTT法对化合物1～6、9和10进行细胞毒活性测试。供试肿瘤细胞包括：K562人慢性髓原白血病细胞、BEL-7402肝癌细胞、SGC-7901胃癌细胞、A549肺癌细胞、Hela 人宫颈癌细胞，供试细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。以相同浓度的DMSO溶剂作为阴性对照组，顺铂作为阳性对照组。将待测样品分别设：1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032 mg/ mL 6个浓度梯度。选取对数生长期的细胞接种在96孔板上。细胞K562直接加入10 μL样品，其余肿瘤细胞株需在培养箱中培养24 h后，再加入10 μL样品。培养72 h后，在显微镜下观察每孔细胞的形态。将15 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液加入到每孔细胞中，置于37 °C反应4 h后，弃去上清液，每孔中加入150 μL DMSO，振荡混匀，用酶标仪测量每孔的OD值(490 nm为测量波长)。计算其抑制率为50%的时候样品浓度即IC50值。

抑制率 = (对照组OD值-实验组OD值)/

对照组OD值×100%

3 结果与分析

3.1 菌株鉴定

菌株初始长出的菌丝均为无色，后变为灰色，菌落背面为深灰色及少许褐色，其孢子呈两端钝圆的圆柱状。将扩增的序列在GenBank上进行BLAST比对，选取与其同源性较高的菌株，使用MEGA X构建系统发育树(图1)

图1 基于ITS序列同源性的真菌HK-08的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain HK-08

结果显示，菌株HK-08与Colletotrichumsp.(KM036382.1)在同一分支上，且与其BLAST同源比对相似度达99%，因此，鉴定该菌株HK-08为真菌Colletotrichumsp.HK-08。

3.2 结构鉴定

化合物1无色油状(CHCl3)；分子式为C12H16O3；ESI-MS：m/z231.2[M + Na]+；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.13(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3，5)，3.54(2H，s，H-7)，4.08(2H，t，J= 6.7 Hz，H-9)，1.60(2H，m，H-10)，1.34(2H，m，H-11)，0.91(3H，t，J= 7.4 Hz，H-12)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：126.3(C-1)，130.6(C-2，6)，115.6(C-3，5)，154.9(C-4)，40.7(C-7)，172.5(C-8)，65.0(C-9)，30.7(C-10)，19.2(C-11)，13.9(C-12)。以上数据与文献[8]报道基本一致，确定化合物1为butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate。

化合物2无色油状(CHCl3)；分子式为C10H12O3；ESI-MS：m/z181.2[M + H]+；1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.08(2H，d，J= 7.9 Hz，H-2，6)，6.77(2H，d，J= 8.1 Hz，H-3，5)，5.17(1H，s，4-OH)，4.23(2H，t，J= 7.1 Hz，H-8)，2.86(2H，t，J= 7.1 Hz，H-7)，2.04(3H，s，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：129.9(C-1)，130.2(C-2，6)，115.5(C-3，5)，154.5(C-4)，34.3(C-7)，65.4(C-8)，171.5(C-9)，21.2(C-10)。以上数据与文献[9]报道基本一致，确定化合物2为4-hydroxyphenethyl acetate。

化合物3无色油状(CHCl3)，分子式为C16H16O2；ESI-MS：m/z263.3[M + Na]+；1H NMR谱给出两个单取代苯环的10个质子信号：δH7.23～7.36(8H，m，H-2，3，4，5，6，13，14，15)，7.18(2H，d，J= 8.1 Hz，H-12，16)；3个亚甲基信号：δH4.34(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.63(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10);13C NMR谱显示该化合物共有16个碳原子，其中包括12个苯环碳，3个亚甲基碳δC41.6(C-7)，65.5(C-9)，35.2(C-10)和1个羰基碳δC171.7(C-8)。1H-1H COSY谱中H2-9与H2-10有相关信号。HMBC谱中，亚甲基质子H2-7与C-1、2、6、8有相关信号，H2-9与C-8、10、11有相关信号，亚甲基质子H2-10与C-9、11、12、16有相关信号。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.23～7.36(8H，m，H-2，3，4，5，6，13，14，15)，7.18(2H，d，J= 8.1 Hz，H-12，16)，4.34(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.63(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：133.9(C-1)，126.7～129.4(10C，Ar-C)，41.6(C-7)，171.7(C-8)，65.5(C-9)，35.2(C-10)，137.8(C-11)。综合以上信息，确定化合物3为phenethyl 2-phenylacetate[10]，并且首次报道其核磁数据。

化合物4无色油状(CHCl3)；分子式为C16H16O3；ESI-MS：m/z279.3[M + Na]+；1H NMR谱中呈现了一个单取代苯环的氢信号：δH：7.24～7.33(3H，m，H-13，14，15)，7.19(2H，d，J= 7.4 Hz，H-12，16)；一个对位取代苯环的氢信号：7.10(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)；3个亚甲基信号：δH4.33(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.55(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)。13C NMR谱中显示该化合物共有16个碳原子，其中包括12个苯环碳信号δC125.8(C-1)，130.6(C-2，6)，115.7(C-3，5)，155.0(C-4)，137.8(C-11)，128.6-129.1(C-12，13，15，16)，126.7(C-14)；3个亚甲基碳δC40.6(C-7)，65.6(C-9)，35.1(C-10)；1个羰基碳δC172.5(C-8)。1H-1H COSY谱中H2-9与H2-10有相关信号。HMBC谱中，亚甲基质子H2-7与C-1、2、6、8有相关信号，H2-9与C-8、10、11有相关信号，亚甲基质子H2-10与C-9、11、12、16有相关信号。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δH：7.24～7.33(3H，m，H-13，14，15)，7.19(2H，d，J= 7.4 Hz，H-12，16)，7.10(2H，d，J= 8.1 Hz，H-2，6)，6.76(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)，4.33(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.55(2H，s，H-7)，2.95(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CDCl3，125 MHz)δC：125.8(C-1)，130.6(C-2，6)，115.7(C-3，5)，155.0(C-4)，40.6(C-7)，172.5(C-8)，65.6(C-9)，35.1(C-10)，137.8(C-11)，128.6-129.1(C-12，13，15，16)，126.7(C-14)。确定化合物4为phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate[11]，并且首次报道其核磁数据。

化合物5黄色油状(CH3OH)；分子式为：C16H16O4；ESI-MS：m/z273.3[M + H]+；1H NMR谱中呈现了一个邻位取代苯环的氢信号：7.09(2H，m，H-4，6)，6.78(2H，m，H-3，5)；一个对位取代苯环的氢信号：6.97(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.69(2H，d，J= 8.4 Hz，H-13，15)；3个亚甲基信号：4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.57(2H，s，H-7)，2.79(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)。13C NMR谱中给出了16个碳信号，包括12个苯环碳信号，3个亚甲基信号和1个羰基信号。1H-1H COSY谱中H2-9与H2-10有相关信号。HMBC谱中，亚甲基质子H2-7与C-1、2、6、8有相关信号，H2-9与C-8、10、11有相关信号，亚甲基质子H2-10与C-9、11、12、16有相关信号。1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.09(2H，m，H-4，6)，6.97(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.78(2H，m，H-3，5)，6.69(2H，d，J= 8.4 Hz，H-13，15)，4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.57(2H，s，H-7)，2.79(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：122.5(C-1)，156.7(C-2)，115.3(C-3)，129.3(C-4)，120.5(C-5)，132.1(C-6)，36.7(C-7)，174.2(C-8)，66.9(C-9)，35.3(C-10)，130.2(C-11)，130.9(C-12，16)，116.2(C-13，15)，156.9(C-14)。以上数据与文献[12]报道基本一致，确定化合物5为4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl) acetate。

化合物6无色油状(CH3OH)；分子式为C16H16O4；ESI-MS：m/z273.3[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.01(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2，6)，6.96(2H，d，J= 8.4 Hz，H-12，16)，6.66～6.73(4H，m，H-3，5，13，15)，4.20(2H，t，J= 6.9 Hz，H-9)，3.47(2H，s，H-7)，2.78(2H，t，J= 6.9 Hz，H-10)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：126.3(C-1)，130.1(C-2，6)，116.3(C-3，5)，156.9(C-4)，41.3(C-7)，174.0(C-8)，66.9(C-9)，35.1(C-10)，129.9(C-11)，131.3(C-12，16)，116.2(C-13，15)，157.5(C-14)。以上数据与文献[12]报道基本一致，确定化合物6为4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl) acetate。

化合物7浅黄色晶体(CH3OH)；分子式为C7H6O2；ESI-MS：m/z123.1[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：9.72(1H，s，H-7)，7.74(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2，6)，6.88(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3，5)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：130.1(C-1)，133.4(C-2，6)，116.9(C-3，5)，165.5(C-4)，192.6(C-7)。以上数据与文献[13]报道基本一致，确定化合物7为对羟基苯甲醛。

化合物8淡黄色油状(CH3OH)；分子式为C8H10O2；ESI-MS：m/z139.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.03(1H，d，J= 7.5 Hz，H-3)，6.98(1H，t，J= 7.7 Hz，H-5)，6.71(1H，d，J= 7.6 Hz，H-6)，6.70(1H，t，J= 7.6 Hz，H-4)，3.70(2H，t，J=7.0 Hz，H-8)，2.79(2H，t，J= 7.1 Hz，H-7)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：156.4(C-1)，126.6(C-2)，131.8(C-3)，120.5(C-4)，128.4(C-5)，116.1(C-6)，35.1(C-7)，63.2(C-8)。以上数据与文献[14]报道基本一致，确定化合物8为2-羟基苯乙醇。

化合物9白色晶体(CH3OH)；分子式为C7H6O3；ESI-MS：m/z139.1[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.87(2H，d，J= 8.7 Hz，H-3，5)，6.81(2H，d，J= 8.7 Hz，H-2，6)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：163.7(C-1)，115.8(C-2，6)，131.7(C-3，5)，122.8(C-4)，169.3(C-7)。以上数据与文献[15]报道基本一致，确定化合物9为对羟基苯甲酸。

化合物10白色粉末(CH3OH)；分子式为C8H8O2；ESI-MS：m/z137.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.85(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3，5)，6.80(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2，6)，2.49(3H，s，H-8)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：162.8(C-1)，115.6(C-2，6)，130.0(C-3，5)，129.1(C-4)，197.1(C-7)，26.2(C-8)。以上数据与文献[16]报道基本一致，确定化合物10为对羟基苯乙酮。

化合物11黄色油状(CH3OH)；分子式为：C10H11NO2；ESI-MS：m/z178.2[M + H]+；1H NMR(CD3OD，500 MHz)δH：7.26(1H，d，J= 7.5 Hz，H-4)，7.09(1H，t，J= 7.6 Hz，H-6)，6.74(1H，t，J= 7.4 Hz，H-5)，6.60(1H，d，J= 7.9 Hz，H-7)，5.35(1H，s，H-8a)，4.00(1H，ddd，J= 8.7，8.0，2.5 Hz，H-3α)，3.61(1H，ddd，J= 9.7，9.2，5.3 Hz，H-3β)，2.37(1H，ddd，J= 11.2，10.8，7.3 Hz，H-2α)，2.27(1H，ddd，J= 11.9，5.3，2.5 Hz，H-2β)；13C NMR(CD3OD，125 MHz)δC：67.8(C-2)，42.4(C-3)，90.0(C-3a)，132.1(C-3b)，125.1(C-4)，119.9(C-5)，130.8(C-6)，110.3(C-7)，151.7(C-7a)，101.4(C-8a)。以上数据与文献[17]报道基本一致，确定化合物11为3a-hydroxyindoline。

3.3 细胞毒活性测试结

对化合物1～6、9和10进行细胞毒活性测试，结果显示，仅化合物4和6对肿瘤细胞有一定的细胞毒活性，其他化合物并未表现出细胞毒活性，活性结果见表1。

表1 化合物4和6的细胞毒活性测试结果

注：a阳性对照。

Note:aPositive control.

4 讨论

本研究运用多种色谱技术从夹竹桃叶内生真菌Colletotrichumsp.HK-08中分离得到11个化合物，均为聚酮类化合物，其中包括6个含苯乙基或苯乙酰基结构的酯类化合物：butyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(1)、4-hydroxyphenethyl acetate(2)、phenethyl 2-phenylacetate(3)、phenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(4)、4-hydroxyphenethyl 2-(2-hydroxyphenyl)acetate(5)、4-hydroxyphenethyl 2-(4-hydroxyphenyl)acetate(6)；4个简单的苯酚类化合物：对羟基苯甲醛(7)、2-羟基苯乙醇(8)、对羟基苯甲酸(9)、对羟基苯乙酮(10)；以及1个生物碱类化合物：3a-hydroxyindoline(11)。本文首次报道了化合物3和4的核磁数据，化合物4、5和11为新的天然产物，化合物1～6和11为首次从Colletotrichum属真菌中分离得到，丰富了Colletotrichum属真菌的次生代谢产物。化合物4和6表现出一定的细胞毒活性，比较化合物3、4、5和6的结构，发现结构中4号位的酚羟基可能对活性起到了重要作用，但还需更多的研究进一步验证，此外，化合物1～6、9和10在对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等人体病原菌的抗性实验中并未表现出抗菌活性。