花椒中的异丁基酰胺化合物及其对HT22海马神经元铁死亡的抑制作用研究

张凯峰，贺鹏杨，何达海

西南民族大学药学院，成都 610041

花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim为芸香科花椒属植物，在中国分布广泛，主要集中在云南、贵州、四川、西藏等省区，是传统的调味品及中药材。四川花椒用于治疗腹痛、腹泻和温脾胃[1,2]。现代药理学研究表明：花椒具有包括抗肿瘤、抗炎、治疗I-型糖尿病等广泛生物活性[3-5]。花椒果实为食用和中药材取材部位，其化学成分丰富，文献报道有异丁基酰胺类化合物[6-9]、生物碱类[10]、木脂素[11]、香豆素[12]、黄酮[12]、精油[13]等。其中的异丁基酰胺类化合物为其主要成分之一。因此，花椒中异丁基酰胺类化合物的结构分析以及活性研究，对花椒的食用安全和用药安全具有重要意义。

泸定县位于四川省西部，二郎山西麓，该地区土壤、日照、热量条件适宜花椒生长。本课题旨在深入研究该地区出产花椒的主要成分之一的异丁基酰胺类化合物，为其质量控制提供物质基础，提升其食用科学性和用药安全，从而提高其附加值，为当地花椒种植户增加收入，提高他们的种植积极性。

我们从泸定县花椒的酸水浸提物中共分离并鉴定了8个异丁基酰胺类化合物和β-谷甾醇，其中化合物1虽然已经被合成出来，但作为天然产物尚属首次。为了探究所分离得到的化合物的生物活性，化合物2～8对erastin诱导的小鼠海马神经元细胞系HT22细胞铁死亡的抑制作用，IC50为4.08 μM。

1 仪器与材料

质谱(HR-ESI-MS)则使用Waters Vion IMS QTof；核磁共振为Bruker，400和600 MHz，以Methanol-d4或CDCl3为溶剂，TMS为内标；制备色谱仪为江苏汉邦DAC80，色谱柱为30 × 250 mm，薄层层析(TLC)硅胶(GF254)和柱层析硅胶(200～300目，青岛海洋化工有限公司)用于柱色谱。反相色谱柱(Cosmosil 75，C18-OPN)为Nacalai Tesque 公司产品。葡聚糖凝胶Sephadex LH-20购自于当地代理商。TLC显色剂用Wagner试剂(碘1 g和碘化钾10 g溶于50 mL水中，加热，加冰醋酸2 mL用水稀释到100 mL)和硫酸香草醛试剂(香草醛0.5 g溶于100 mL硫酸-乙醇(1∶1)溶液)。实验室所用的有机溶剂以及其它耗材等，从成都金牛化工试剂公司购买。

花椒原料于2018年9月采自四川省甘孜州泸定县，经王晓玲教授鉴定为ZanthoxylumbungeanumMaxim，样本存放于西南民族大学少数民族药物标本馆(编号Zb-2018-1)。

2 分离与提纯

将自然阴干的5 kg花椒粉碎(5～10目)，用1.5 L 70%乙醇水(盐酸调节pH=3)常温浸提24小时。抽滤得总浸提液，真空浓缩出去大部分乙醇，氨水调节pH=9～10，用石油醚和乙酸乙酯依次萃取，分别得石油醚萃取物80 g和乙酸乙酯萃取物330 g。石油醚萃取物用硅胶柱色谱常压分离，石油醚-乙酸乙酯(4∶1→5∶1)梯度洗脱，得Zb-P-1～Zb-P-8共8个部分，Zb-P-4继续用硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯4∶1等度洗脱，得化合物9(0.3g)；Zb-P-6用制备液相分离，色谱柱为Ф 30×250 mm，流动相A(甲醇)，流动相B(水)，洗脱条件为0～15 min(A 60%～95%)，15～18 min(A 95%～100%)，18～23 min(A 100%)，流速为35 mL/min，检测波长为254 nm，得化合物7(12 mg)；Zb-P-7制备液相分离，方法同上，得到化合物6(20 mg)。乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱(Ф 10×100 cm)氯仿-甲醇(12∶1→5∶1→1∶1)梯度洗脱，得到Zb-E-1～Zb-E-11共11个部分，硅胶柱色谱分离Zb-E-2，石油醚-乙酸乙酯1∶2等度洗脱，得化合物3(5 mg)；样品Zb-E-3用硅胶柱色谱(Ф 8×80 cm)，乙酸乙酯-甲醇20∶1等度洗脱得到Zb-E-3-1～Zb-E-3-4共4个部分，Zb-E-3-1继续用硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯1∶2等度洗脱得到化合物2(8 mg)、5(6 mg)和8(6 mg)；Zb-E-6硅胶柱色谱分离，方法同样品Zb-E-3-1的分离，得到化合物4(9 mg)；样品Zb-E-7用硅胶柱色谱分离，然后用高效液相色谱分离(方法同上述液相色谱方法)的混合物同分异构体Zb-E-725，高效液相色谱(甲醇-水35%)等度洗脱得到同分异构体1b(混有1a)和化合物1a(2 mg)。

3 活性测试

3.1 细胞培养

HT22 细胞置于含5% CO2、37 ℃恒温箱中，使用含10% 胎牛血清的DMEM 培养基培养。

3.2 CCK-8实验

参照文献[14]方法略做修改，HT22细胞以10 000个/孔的密度接种于96孔板中，孵育过夜后，加入5 μM的化合物，预处理4 h。随后加入1 μM的Erastin，继续处理24 h。每孔中加入CCK-8 试剂10 μL，培养箱内，37 ℃孵育1 h，酶标仪上读取450 nm 处的吸光值。细胞存活率每组按照以下公式计算。实验重复3次。

细胞存活率=(处理组-空白对照组)/

(对照组-空白对照)×100%

3.3 细胞形态学观察

在96 孔板中种植HT22 细胞，当细胞密度长到约为60%～70% 时，预处理药物4 h，再加入1 μM Erastin 作用24 h后，在倒置显微镜下观察相关细胞的形态，并拍照记录。实验重复3 次。

3.4 统计学分析

所有数据应用GraphPad Prim 6.0统计学软件进行分析。

4 结构与鉴定

化合物1浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z292.223 7[M+Na]+(calculated for C16H31NO2Na，292.224 7)，m/z253.231 2[M-OH]+(calculated for C16H30NO，253.223 2)；1H NMR(600 MHz，CD3OD)显示两个乙烯基质子δ：6.79(1H，dt，J=7.0，15.3 Hz，H-3)，5.98(1H，dt，J=1.4，15.3 Hz，H-2)，一个氨基取代次甲基3.25(1H，s，H-1′)，一个甲基0.89(1H，t，J=7.0 Hz，H-12)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：167.8(s，C-1)，144.7(d，C-3)，123.2(d，C-2)，70.2(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，31.2(t，C-6)，29.2(t，C-8)，29.1(t，C-10)，29.0(t，C-9)，28.8(t，C-7)，28.1(t，C-5)，25.8(q，C-3′，C-4′)，22.3(t，C-11)，13.0(q，C-12)。上述数据与文献[15]报道合成化合物数据基本一致，化合物的被证实为(2E)-N-(2-hydroxy-2-methylpropyl)-dodec-2-enamide，该化合物被Menozzi-Smarrito等[14]首先合成出来。通过SCIfinder检索显示，该化合物作为天然产物尚属首次[15,16]，命名为花椒素A(zanthoxylumol A)。

化合物2浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z286.178 3[M+Na]+(calculated for C16H25NO2Na，286.177 7)，m/z246.184 5[M-OH]+(calculated for C16H24NO，246.185 2)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.19(6H，s，Me-3′ and Me-4′)，1.78(3H，d，J=6.8 Hz，Me-12)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.6(s，C-1)，143.7(s，C-3)，133.3(s，C-9)，131.9(s，C-10)，129.5(d，C-11)，129.2(d，C-7)，129.1(d，C-6)，125.1(d，C-8)，123.7(d，C-2)，70.2(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，31.8(t，C-4)，26.2(t，C-5)，25.9(q，C-3′，C-4′)，17.0(q，C-12)。上述数据与文献[9]报道基本一致，主要差异原因在于溶剂效应，文献所用的氘代溶剂为氯仿，而我们用的氘代溶剂为甲醇。故鉴定化合物2为hydroxy-α-sanshool。

化合物3浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z318.242 1[M+Na]+(calculated for C18H33NO2Na，318.240 3)，m/z278.248 6[M-OH]+(calculated for C18H32NO，278.247 8)；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.15(1H，dd，J=10.5，15.1 Hz，H-3)，6.01(1H，d，J=15.1 Hz，H-2)，1.20(6H，s，Me-3′ and Me-4′)，0.92(3H，t，Me-14)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.2(s，C-1)，142.8(d，C-5)，141.2(d，C-3)，128.4(d，C-4)，121.5(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(s，C-1′)，32.6(t，C-6)，31.7(t，C-12)，29.3(t，C-8)，29.2(t，C-9)，29.0(t，C-10)，28.9(t，C-11)，28.6(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，22.3(t，C-13)，13.0(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物3为tetrahydrobungeanool。

化合物4浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z312.194 1[M+Na]+(calculated for C18H27NO2Na，312.193 4)；m/z272.201 01[M-OH]+(calculated for C18H26NO，272.200 8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，141.8(d，C-5)141.0(d，C-3)，132.1(d，C-8))，131.7(d，C-12)，131.3(d，C-9)，131.1(d，C-10)，130.1(d，C-11)，128.8(d，C-13)，128.3(d，C-4)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)32.5(t，C-6)，31.8(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，16.9(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物4为hydroxy-γ-isosanshool。

化合物5浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z312.194 1[M+Na]+(calculated for C18H27NO2Na，312.193 4)，离子峰m/z272.201 0[M-OH]+(calculated for C18H26NO，272.200 8)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，141.8(d，C-5)，141.0(d，C-3)，133.2(d，C-11)，131.9(d，C-12)，129.4(d，C-9)，129.3(d，C-8)，129.1(d，C-13)128.9(d，C-4)，125.2(d，C-10)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.7(d，C-1′)，32.6(t，C-6)，26.7(t，C-7)，26.0(q，C-3′，C-4′)，17.0(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物5为hydroxy-γ-sanshool。

化合物6浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z314.208 9[M+Na]+(calculated for C18H29NO2Na，314.209 0)，m/z274.217 22[M-OH]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，142.0(d，C-5)，141.0(d，C-3)，131.3(d，C-11)，128.8(d，C-9)，128.6(d，C-4)，128.3(d，C-12)，126.8(d，C-8)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(d，C-1′)，32.5(t，C-6)，26.2(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，25.0(t，C-10)，20.1(t，C-13)，13.2(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物6为(2E, 4E,8Z,11Z)-2′-hydroxy-N-isobutyl-2,4,8,11-tetradecatetraenamide(bungeanool)。

化合物7浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z296.199 4[M+Na]+(calculated for C18H27NONa，296.198 4)，m/z274.217 22[M+H]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.1(s，C-1)，141.5(s，C-5)，140.6(d，C-3)，133.2(d，C-11)，131.9(d，C-12)，129.4(d，C-9)，129.3(d，C-8)，129.1(d，C-13)，128.9(d，C-4)，125.2(d，C-10)，122.0(d，C-2)，46.7(d，C-1′)32.6(t，C-6)，28.4(d，C-2′)，26.8(t，C-7)，19.2(q，C-3′，C-4′)，17.1(q，C-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：166.3(s，C-1)，141.8(d，C-5)，140.0(d，C-3)，133.4(d，C-11)，131.8(d，C-12)，130.0(d，C-9，C-13)，129.5(d，C-8)，128.7(d，C-4)，125.4(d，C-10)，122.2(d，C-2)，46.9(d，C-1′)，33.0(t，C-6)，28.6(d，C-2′)，27.1(t，C-7)，20.1(q，C-3′，C-4′)，18.3(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定化合物7为γ-sanshool。

化合物8浅黄色油状物；紫外254 nm有暗斑；Wagner试剂呈阳性；HR-ESI-MS:m/z314.208 9[M+Na]+(calculated for C18H29NO2Na，314.209 0)，m/z274.217 22[M-OH]+(calculated for C18H28NO，274.216 5)；显示其中含有化合物5；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：168.1(s，C-1)，142.0(d，C-5)，141.0(d，C-3)，132.0(d，C-11)，128.8(d，C-9)，128.5(d，C-4)，128.3(d，C-12)，127.0(d，C-8)，121.8(d，C-2)，70.3(s，C-2′)，49.8(d，C-1′)，32.6(t，C-6)，29.9(t，C-10)，26.2(t，C-7)，25.8(q，C-3′，C-4′)，20.1(t，C-13)，12.9(q，C-14)。上述数据与文献[9]报道一致，故鉴定该化合物为(2E,4E,8Z,11E)-2′-hydroxy-N-isobutyl-2,4,8,11-tetradecatetraenamide(isobungeanool)。

化合物9白色针状晶体；喷洒硫酸香草醛试剂加热显暗红色；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.53(1H，m，H-3)，5.37(1H，d，J=4.4 Hz，H-6)，1.03(3H，s，Me-19)，0.93(3H，d，J=6.6 Hz，Me-21)，0.87，0.84，0.82(3×3H，s，Me-26，27，29)，0.70(3H，s，Me-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.3(t，C-1)，31.7(t，C-2)，71.8(d，C-3)，42.3(t，C-4)，140.8(s，C-5)，121.7(d，C-6)，31.9(t，C-7)，31.9(t，C-8)，50.1(d，C-9)，36.5(s，C-10)，21.1(t，C-11)，39.8(t，C-12)，42.3(s，C-13)，56.1(d，C-14)，24.3(t，C-15)，28.3(t，C-16)，56.8(d，C-17)，11.9(q，C-18)，19.4(q，C-19)，36.2(d，C-20)，18.8(q，C-21)，34.0(t，C-22)，26.1(t，C-23)，45.8(d，C-24)，29.2(d，C-25)，19.8(q，C-26)，19.0(q，C-27)，23.1(d，C-28)，12.0(q，C-29)。上述数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物9为β-为谷甾醇。

5 HT22铁死亡抑制活性测试结果

化合物1的量太少，没有进行生物活性测试。化合物2～8接受了对HT22小鼠海马神经元铁死亡抑制活性测试。

HT22 细胞板培养24 h 后，普通倒置显微镜下观察发现未加入Erastin的正常HT22 细胞贴壁生长，细胞呈两极或多极，突起明显，突起之间相互交织成网状，细胞膜光滑且完整，胞体折光性强(图1A)。加入1 μM Erastin诱导细胞损伤24 h后，细胞生长被抑制，诱导损伤后形态学显示，胞体轴突减少，细胞皱缩，胞质凝聚，细胞间连接减少，细胞贴壁不紧，胞体折光性下降有明显的收缩(图1B)；同样损伤后，采用5 μM的化合物3干预24 h，对比发现化合物3组与空白对照组(图1B)相比，细胞数目回升，细胞形态改善，细胞的收缩程度也有所恢复，胞体折光性增强(图1C)。阳性对照组的细胞形态具有显著的改善(图1D)。

给予已损伤细胞不同浓度化合物3(1、2、5、10、20 μM)干预，CCK8 检测其细胞存活率。结果显示，Erastin(1 μM)损伤，化合物3(1、2、5、10、20 μM)干预24 h 后，细胞的存活率分别为9.84%、 34.65%、65.71%、73.40%和71.28%。阳性对照化合物Ferrostatin-1(0.1、0.2、0.5、1、2 μM)干预时细胞的存活率分别为5.45%、20.95%、48.96%、86.85%和102.06%。上述实验结构显示化合物3干预组随浓度的升高(图2)，可以逆转Erastin损伤造成的HT22细胞存活率的浓度依赖性下降。

图2 细胞存活率与化合物3浓度依赖关系Fig.2 Cell viability dependent on the concentration of compound 3注：A为阳性对照；B为化合物3。Note:A represents positive control;B represents compound 3.

化合物3在本实验中显示出较强的Erastin诱导的铁死亡抑制活性，以Ferrostatin-1为阳性对照(IC50为0.35 μM)，其IC50为4.08 μM。其余化合物均没有活性。

6 结论

本文总共从花椒中分离并鉴定了9个化合物，其中8个为异丁基酰胺类化合物。异丁基酰胺类化合物2～8首次接受了对HT22小鼠海马神经元铁死亡抑制活性测试。其中化合物3表现出较强的抑制活性，为异丁基酰胺类化合物的活性筛选提供了新方向，同时也为海马神经元细胞铁死亡抑制剂的筛选提供了新的植物源。此外，花椒提取物，尤其是花椒中的异丁基酰胺类化合物，可能在神经保护用药开发中的具有良好前景。