Box-Behnken设计-效应面法优化杜仲籽油提取工艺及脂肪酸组成分析*

赵惠茹，曹静思，高 建，靖 会，李璐瑶

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

杜仲为杜仲科植物杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥树皮，具有补肝强肾、强筋健骨、调理冲任、固经安胎等功效[1-2]。杜仲籽为杜仲的翅果籽，杜仲籽油营养成分丰富，含有桃叶珊瑚苷、绿原酸、多聚环烯醚萜苷、脂肪酸等多种成分[3-5]，具有和杜仲类似的功效，主要用于防治腰脊酸疼，风湿痹痛，胎动不安，习惯性流产等，还可清除体内垃圾，加强人体细胞生理代谢，防止骨骼老化，平衡人体血压，是一种很好的功能食品，同时也是生产其他功能食品的良好基料[6-7]。现阶段人们多注重于杜仲皮和杜仲叶的研究开发，对杜仲籽油的开发利用较少[8-11]。常采用亚临界流体萃取、水酶法提取或者以石油醚、正己烷为溶剂，超声波辅助提取，单因素或正交实验优化杜仲籽油提取工艺，虽有简便、实验次数少等优点，但精度不高，预测性较差[12-17]。因此，作者采用Box-Behnken设计-效应面法对杜仲籽油提取工艺进行优化并对其脂肪酸成分进行分析，以期为杜仲籽油的开发利用提供依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

杜仲籽：产自河北省青县流河镇纯丰蔬菜良种繁育场，经西安医学院药学院边军昌老师鉴定为杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的翅果籽；水为超纯水；其他试剂：均为分析纯，市售。

气相色谱-质谱联用仪：7890A/5975C，美国Agilent公司；粉碎机：CS-700，山东鼎坤机械有限公司；电子精密天平：FA1004B，上海越平科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9240B，上海培因实验仪器有限公司；智能数显恒温水浴箱：DZKW-D-2，北京市永光明医疗仪器厂；超声波清洗器：KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪：RE-52，上海亚荣生物仪器厂；循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司；425 μm标准筛：上海丰行筛网制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲籽油的提取

称取杜仲籽粉末10 g，以石油醚(60～90 ℃)为提取溶剂，提取溶剂与杜仲籽粉末按照一定的体积质量比(mL/g，以下简称液料比)、提取时间和提取温度进行回流提取，抽滤后减压蒸馏去除溶剂，60 ℃下干燥至质量恒定得到杜仲籽油，按照提取率=m(杜仲籽油)/m(杜仲籽粉)×100%计算杜仲籽油出油率。

1.2.2 杜仲籽油的GC-MS分析条件

GC条件：HP-5MS 气相色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为高纯氦气；程序升温起始温度50 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min 的速度升温到150 ℃，保持10 min，然后以1 ℃/min 的速度升温到180 ℃，保持10 min，最后以2 ℃/min的速度升温到220 ℃，保持19 min；进样口温度250 ℃，进样量1 μL，以分流比20∶1分流进样；柱流量1 mL/min；溶剂延迟3 min。

MS条件：EI 离子源，全扫描方式，接口温度 250 ℃，离子源温度 230 ℃，四级杆温度150 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围(m/z) 45～450，NIST11标准质谱库。

1.2.3 脂肪酸的甲酯化及组成分析

精密称取0.1 g杜仲籽油于25 mL圆底烧瓶中，加入2 mL丙酮溶剂使之溶解，再加1 mL甲醇溶液和0.1 mL浓硫酸溶液，置于70 ℃恒温水浴箱中连续回流1 h。待冷却后加入正己烷5 mL，并加蒸馏水5 mL，振荡使分散均匀，取上清液，再用5 mL正己烷洗涤1次，合并上清液，加入足量的无水硫酸钠，静置12 h充分干燥，取上清液，通过0.45 μm有机系微孔滤膜过滤，取滤液1 mL按GC-MS条件分析脂肪酸组成。质谱图经解析并与NIST11标准质谱库对照后确定脂肪酸化学结构，利用峰面积归一化法计算各脂肪酸的相对含量。

1.2.4 杜仲籽油提取工艺优化

为了考察提取温度、提取时间、液料比对杜仲籽出油率的影响，在单因素实验基础上，应用Design-Expert 8.0.6.1软件进行三因素三水平实验设计，Box-Behnken设计-效应面法对杜仲籽出油率的提取工艺进行优化。

2 结果与讨论

2.1 杜仲籽油提取的单因素实验

2.1.1 液料比对杜仲籽出油率的影响

称取杜仲籽粗粉5 g共5份，分别以液料比4、8、12、16、20 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，在水浴温度为50 ℃条件下提取150 min，按照1.2.1方法计算杜仲籽出油率，结果见图1。

液料比/(mL·g-1)图1 液料比对杜仲籽出油率的影响

由图1可知，当液料比由4 mL/g增加至8 mL/g时，出油量增长速度较快，继续增加至液料比至20 mL/g，出油量增长不明显。兼顾经济效益节约溶剂的情况，确定液料比为8 mL/g继续进行单因素实验考察。

2.1.2 提取温度对杜仲籽出油率的影响

称取杜仲籽粗粉5 g共5份，以液料比8 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，分别在20、35、50、65、80 ℃水浴温度下提取150 min，按照1.2.1方法计算杜仲籽出油率，结果见图2。

t/℃图2 提取温度对杜仲籽出油率的影响

由图2可知，随着提取温度的升高传质加快，出油率不断增大，t=20～50 ℃出油率增长较快，t>50 ℃后出油率增长不显著，故在进行之后的提取时间单因素实验时，考虑到温度太高可能会使杜仲胶溶出增大，确定50 ℃为提取温度继续进行单因素实验考察。

2.1.3 提取时间对杜仲籽出油率的影响

称取杜仲籽粗粉5 g共5份，以液料比8 mL/g加入石油醚(60～90 ℃)，在50 ℃水浴温度下分别提取60、90、120、150、180 min，按照1.2.1方法计算杜仲籽出油率，结果见图3。

t/min图3 提取时间对杜仲籽出油率的影响

由图3可知，随着提取时间的延长，出油率不断增大。这是由于在提取初期，原料中油脂含量较高，在溶剂中溶解较快，出油量迅速增加，随着提取时间延长，原料中油脂含量减少，油脂在溶剂中的饱和度越来越大，因而在溶剂中溶解减慢，出油量增加相应趋缓。

2.2 Box-Behnken设计-效应面法的实验设计和结果

根据单因素实验结果选择各因素的最佳取值范围。以杜仲籽出油率为考察指标，液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)为实验因素，各水平设计见表1，效应面法设计及结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表1 因素各水平的代码值和实际操作物理量

表2 效应面法实验设计及结果

表3 回归模型方差分析

根据二次回归方程中两两因素对杜仲籽出油率的影响，分别绘制各个因素的三维效应面图见图4～图6。

由图4～图6可知，两两因素交互作用对杜仲籽出油率的影响趋势均较平缓，作用不显著，这与回归模型方差分析中的显著性一致。

图4 液料比和提取温度对杜仲籽出油率的影响

图5 液料比和提取时间对杜仲籽出油率的影响

图6 提取温度和提取时间对杜仲籽出油率的影响

由Design Expert 8.0.6软件分析得最佳提取工艺为液料比14 mL/g，提取温度35 ℃，提取时间90 min。为了验证实验的稳定性，根据优化出的最佳提取工艺条件进行实验，平行做3份，杜仲籽平均出油率为10.96%(RSD为4.82%)，预测值为10.03%，结果表明工艺稳定可靠。

2.3 杜仲籽油的脂肪酸成分分析

应用气质联用仪对杜仲籽油脂肪酸组成进行定性和定量分析，经谱库检索和质谱图解析，见图7。

t/min图7 杜仲籽油脂肪酸成分的总离子流图

由图7可知，杜仲籽油主要由亚油酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸和硬脂酸等脂肪酸组成，其保留时间分别为12.34、13.90、14.97、15.48和16.78 min，相对含量分别为10.54%、13.89%、5.52%、61.73%、2.17%，杜仲籽油中具有较高食用价值和保健作用的不饱和脂肪酸含量高达88.34%。

3 结 论

通过单因素实验和Box-Behnken设计-效应面法优化杜仲籽油提取工艺为药材与提取溶剂石油醚(60～90 ℃)液料比14 mL/g，提取温度35 ℃，提取时间90 min，影响杜仲籽油提取率因素的主次顺序依次为液料比>提取温度>提取时间。在此工艺条件下，杜仲籽出油率为10.96%，实验精度高，重现性好。GC-MS分析其脂肪酸主要为不饱和脂肪酸，且含量最高的为亚麻酸，可达61.73%，有一些出峰明显但不属于脂肪酸的成分经过对比后初步鉴定为苯丙素类、木质素类以及黄酮类等成分，具体结构的确认有待于进一步研究。