超声提取联合膜分离技术纯化甘草酸的工艺

牛志超，高少雄，郑晓宇

中国石油大学（北京）理学院（北京 102249）

甘草是我国传统中药材中用量最大的草药之一，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的作用，中医常有“十方九草，无草不成方”的说法，也是国家卫生部批准的药食同源食物之一[1]。甘草酸又称甘草甜素属三萜皂苷类，是甘草最主要的活性成分之一，也是甘草甜味的重要来源，甜度为蔗糖甜度的80～300倍[2]，研究发现，甘草酸除具有保肝、镇咳、抗炎、抗菌、抗病毒和抗氧化等作用外，还能防治病毒性肝炎、艾滋病、高血脂症和老年性痴呆及增强机体免疫功能[3-6]。由于甘草酸有着广泛的应用范围，包括食品、医药、化妆品领域，因此建立一种高效快捷分离纯化甘草酸的方法有着十分重要的意义。

在公开报道的文献中，关于甘草酸提取的方法有很多[7-8]，包括水提法、氨醇提取法、超声提取法、微波提取法以及超临界流体提取法等，其中超声波提取法具有耗时少、提取效率高、设备简单易操作的优势[9]。关于甘草酸提取液的纯化方法主要有重结晶法、树脂法、聚酰胺法等，而上述甘草酸纯化方法均存在劳动强度大、效率低、容易二次污染等不足。膜分离技术作为一种新型的分离技术，不仅具有操作简便、能耗低的特点，还不存在传统纯化方法的有机溶剂残留问题，尤其适用于天然产物热等稳定性差的生物产品分离，已被广泛应用于多糖、生物酶等活性物质的分离纯化[10]。

试验以新疆甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）为原料，采用超声提取与膜分离技术联用，利用微滤（MF）对甘草酸提取液进行分离纯化，通过正交试验确定一条适合工业化生产的甘草酸提取纯化工艺路线，为工业生产提供一定的技术支持。

1 材料与设备

甘草，购于新疆当地药材公司；甘草酸分析对照品，上海麦克林生化科技有限公司，纯度大于98%；氨水、乙醇、甲醇等试剂均为分析纯。

膜分离设备（实验室自制）；尼龙微滤膜（0.10，0.22，0.45和0.65 μm），北京北化黎明膜分离技术有限公司；UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）；KQ3200DE型数控超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；DZF-6050型真空干燥箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。

2 方法与结果

2.1 甘草酸含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备

称取0.025 0 g甘草酸标准品，用70%乙醇溶液定容于25 mL容量瓶，配成1 mg/mL的溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备

精密称取5 g甘草粉末（过3号筛），固液比为1∶10（g/mL），用70%乙醇于60 ℃恒温热回流提取4 h，过滤，提取液冷却备用。

2.1.3 绘制甘草酸标准曲线

精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL甘草酸对照品溶液，分别置于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容配置得到质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08和0.10 mg/mL甘草酸标准品溶液，依次标记为1～5号样品，以70%的乙醇溶液作为空白溶液，在200～400 nm波长范围内扫描测得最大吸收波长250 nm，如图1所示。

以甘草酸标准品在250 nm的吸光度为纵坐标，其对应的浓度为横坐标，通过二元回归法绘制标准曲线图，得到标准曲线，见图2。

对所测数据采用回归法进行线性回归处理，得到标准曲线的回归方程：Y=17.355X+0.060 7，r2=0.999 6。

图2 甘草酸标准曲线

精密度试验：移取2.5 mL对照品溶液于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液进行定容，摇匀，在250 nm处分别测定6次吸光度。经过计算，6次测定结果的相对标准偏差为0.56%，结果表明精密度良好。

重复性试验：取2.5 mL供试品溶液于25 mL容量瓶中，加70%乙醇溶液至刻度线，摇匀，测定其在250 nm处的吸光度，测定6次。经过计算，6次测定结果的相对标准偏差为1.31%，结果表明重复性良好。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 提取溶剂的选择

按照固液比1∶10（g/mL）、提取时间2 h、提取温度60 ℃，分别选择去离子水、70%乙醇、甲醇、含氨0.5%的70%乙醇溶液作为提取溶剂，进行热回流提取试验。移取0.5 mL提取液于25 mL容量瓶中，再用70%乙醇溶液定容，测定其在250 nm处的吸光度，代入回归方程测定甘草酸含量，计算提取率，以甘草酸提取率为评价指标进行考察。甘草酸收率按式（1）计算。

式中：n表示提取液稀释倍数；C表示测定的甘草酸质量浓度，mg/mL；V表示提取液体积，mL；m表示甘草的质量，mg。

四种溶剂的提取结果如图3所示，当提取溶剂为70%乙醇溶液时，甘草酸收率最高，为6.13%，然后是含氨0.5%的70%乙醇溶液，甘草酸收率为5.62%，最后为无水甲醇和去离子水，二者的甘草酸收率相近，分别为4.18%和4.34%。

图3 不同溶剂提取效果的比较

由于甘草酸为五三萜皂苷，含有多个苯环及酚羟基结构，苯环为非极性基团，具有疏水性，易溶于有机溶剂，而酚羟基为极性基团，具有亲水性，易溶于水，所以甘草酸在70%乙醇溶液中的溶解度大于在无水甲醇和去离子水中的溶解度，相应的甘草酸收率也高于无水甲醇和去离子水。而70%乙醇溶液的甘草酸收率会高于含氨0.5%的70%乙醇溶液，则可能是因为甘草酸中含有羧基，与稀氨水反应会转化为甘草酸铵盐，而试验在建立甘草酸分析方法时所使用的对照品为甘草酸标准品，因此甘草酸在含氨0.5%的70%乙醇溶液的浓度会减小，低于其在70%乙醇溶液的浓度，造成收率下降。考虑到甘草酸的应用范围主要为医疗、食品和化妆品领域，因此试验选择70%乙醇溶液作为研究甘草酸的提取溶剂。

2.2.2 提取工艺正交试验

以甘草酸提取率为评价指标，选取超声功率（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、固液比（D）为考察因素，采用L9(34)正交设计优选甘草酸的最优提取工艺条件，因素水平见表1，正交试验结果见表2。由正交试验结果表可以看出各因素对甘草酸提取结果影响的主要次序为温度（B）＞功率（A）＞时间（C）＞固液比（D）。最佳条件为A3B2C2D2，即提取功率180 W、提取温度70 ℃、提取时间75 min、固液比1∶20（g/mL）。

2.2.3 提取工艺验证试验

分别称取10 g甘草粉末，在上述最佳工艺条件下进行超声辅助提取，平行提取3次，测得甘草酸提取率分别为7.78%，7.63%和7.71%，平均提取率为7.71%，说明优选的条件重复性好，稳定可靠。

表1 正交试验因素水平表

表2 提取工艺正交试验结果

2.3 膜分离工艺研究

2.3.1 提取液的制备

在超声辅助提取试验的基础上，按照正交优化最佳工艺条件，称取甘草粉末进行超声提取，将甘草酸提取液经2 800 r/min离心25 min，取上清液，备用。

2.3.2 膜分离工艺正交试验

根据相关文献关于中药提取液微滤过程产生影响的主要因素[11]，选择膜孔径（A）、药液温度（B）、过膜压力（C）为考察因素，以甘草酸保留率、除杂率作为评价指标，采用L9(34)正交设计试验，对膜分离的最佳工艺条件进行优化，因素水平表见表3，正交试验结果见表4。

式中：T表示甘草酸保留率，%；Cn表示过膜之后滤液中的甘草酸含量，mg/mL；Cm表示提取液中甘草酸含量，mg/mL；R表示除杂率，%；M1表示未过膜提取液的酸沉出膏量，mg；M2表示过膜样品出膏量，mg。

由正交试验结果表可以看出在微滤工艺过程中对甘草酸保留率产生影响的各因素从大到小主要顺序为压力（C）、孔径（A）、温度（B），最佳条件为A3B1C1，即膜孔径0.45 μm、药液温度30 ℃、压力0.1 MPa。各因素对除杂率产生影响的顺序大小依次为孔径（A）、压力（C）、温度（B），最佳条件为A1B3C1，即膜孔径0.10 μm、药液温度40 ℃、压力0.1 MPa。综合分析，压力（C）对甘草酸保留率和除杂率均有显著影响，因此压力选择0.1 MPa，而孔径（A）对甘草酸保留率的影响没有其对除杂率的影响显著，因此孔径应选择0.10 μm，温度（B）对保留率和除杂率速均无显著影响，考虑生产过程中的实际成本，温度应选择30 ℃。综合以上几点，最终选取A1B1C1为最佳微滤工艺条件，即膜孔径0.10 μ m、药液温度30 ℃、压力0.1 MPa。

表3 正交试验因素水平表

表4 微滤工艺正交试验结果

2.3.3 微滤工艺验证试验

将超声辅助提取过后的甘草酸提取液按2.3.1项离心操作后，分3次在所得最优微滤工艺条件下进行验证，甘草酸保留率分别为97.16%，96.35%和96.92%，甘草酸平均保留率为96.81%，除杂率分别为15.29%，15.37%和14.75%，平均除杂率为15.14%，说明优选的条件稳定可行。

3 结论与讨论

采用超声辅助提取联合微滤膜分离技术，以建立一种适合工业化生产的甘草酸提取纯化工艺路线为研究目的，通过正交试验考察了不同因素对甘草酸的提取和微孔滤膜对甘草酸提取液纯化除杂的影响。选用70%乙醇溶液作为提取剂，提取溶剂与甘草酸粉末固液比为1∶20（g/mL），在180 W，70 ℃下超声提取75 min，甘草酸平均提取率为7.71%。

由于在提取液中存在很多包括糖类、蛋白质、胶质等在内的大分子物质，在使用膜对中药提取液进行分离纯化时，不可避免地会造成膜孔的堵塞污染，降低膜的使用寿命，导致在工业化时成本较高。而相关文献报道，当膜在低于其负荷极限的情况下过滤时可有效降低膜的不可逆污染问题[12]。因此在微滤工艺正交优化过程中，所得最优过膜压力为0.1 MPa，保证滤膜在去除糖类、蛋白质等大分子杂质时，使用寿命得到有效延长，降低工业化成本的同时，为后续采用超滤技术及固体膜萃取技术进一步分离纯化甘草酸奠定基础。