6个红紫芽茶14种化学成分含量测定比较

念波 ，段双梅，石兴云，马燕，王兴华，赵明 ,

1. 云南农业大学龙润普洱茶学院（昆明 650201）；2. 云南农业大学云南省药用植物生物学重点实验室（昆明 650201）；3. 云南省德宏州茶叶技术推广站（德宏 678400）；4. 普洱市茶叶科学研究所（普洱 665000）

花青素是在许多植物中发现的植物色素，包括红葡萄[1]，浆果（蓝莓、草莓、黑加仑子、越桔）[2]，茄子[3]，紫薯[4]，芙蓉花[5]，这些色素是自然界中重要的水溶性天然色素，属于酚类化合物中的类黄酮物质，也是形成花瓣和果实颜色的主要色素之一，可随细胞液的酸碱改变颜色。在酸性液中偏红，碱性液中则偏蓝[6]。花青素具有很强的抗氧化[7]，清除体内的自由基[8]，抗癌能力[9]，改善血管壁弹性，从而达到降压功能[10]；对心血管疾病的防治有很大作用[11-12]，由于花青素对人体的潜在益处，人们对它的兴趣因此增加[13]，同时花青素还是一种无毒的天然着色剂[14]，在医药、化妆品、食品等领域有着广阔的发展空间和价值[15]。近年来花青素的营养、药理等作用逐渐引起关注，具有良好的应用和开发前景。

茶树（Camellia sinensis（L.）O. Kuntze）是山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）的多年生常绿作物。茶树叶片颜色一般是黄绿色，但基因改变或受环境因素的影响，芽叶颜色会呈现红紫色。根据茶叶花青素含量的研究发现芽叶红字颜色的深浅与花青素含量的多少呈正相关：花青素含量越高，芽叶紫色程度越深[16]。紫娟在红紫芽茶树中具有典型代表性，并且国家林业局于2005年11月批准其为植物新品种，并授权给予保护，品种权号20050031[11]。采摘的鲜叶加工可以制成晒青或者烘青，干茶色泽为紫黑色，冲泡茶汤为淡紫色，叶底呈靛青色，香气纯正，味浓回甘[17]。根据动物试验结果表明，紫娟绿茶降压效果幅度35.53%，维持至20 min，高于云南大叶群体种绿茶（29.04%，1 min）。紫娟嫩稍内含成分极其丰富，其中最突出的是花青素，据王兴华等研究显示紫娟新稍中花青素含量29.14 mg/g，是日本高花青素茶树品种“枕佃03—1384”（花青素0.30～0.37 mg）的100倍左右[18]。因紫娟花青素含量高，利用价值高，从而得到广泛推广，形成较系统的繁育推广技术平台。

红紫芽茶树是一种稀有、独具特色、富含高花青素的茶树资源[19]。为充分利用红紫芽茶树种质资源，试验对思茅茶树良种场资源圃中的紫娟和红紫芽茶进行花青素、儿茶素等测定分析，并与紫娟茶做了比较分析，为培育优质茶叶品种提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

紫娟和5个不同嫩度的红紫芽茶鲜叶，于2016年9月采自思茅茶树良种场资源圃，如图1。

1.1.2 主要试剂

使用高效液相色谱测定法（HPLC）测定花青素、儿茶素、咖啡碱含量。

甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA试剂公司）；没食子酸（GA）标品、咖啡碱（CA）标品、儿茶素（C）标品、表没食子酸儿茶素（EGC）标品、表儿茶素（EC）标品、1, 4, 6-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（G-G）标品、表儿茶素没食子酸酯（ECG）标品、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）标品（天津一方科技有限公司）。

1.1.3 主要仪器与设备

粉末颜色值中L*、b*、ΔE*ab值与姜黄素类各成分的含量均呈现极显著的负相关关系，a*值与姜黄素类各成分的含量均呈现极显著的正相关关系。

高效液相色谱仪1200（美国Agilent公司）；电子分析天平AR-1140（上海奥豪斯仪器有限公司）；数显恒温水浴锅HH-S28S（金坛市大地自动化仪器厂）；电热鼓风恒温干燥箱101A-2（上海市崇明实验仪器厂）；实验室蒸馏水机（上海和泰仪器有限公司）；高速多功能粉碎机CS-2000（武义海纳电器有限公司）。

表1 试验样品采摘信息表

图1 茶叶样品图

1.2 方法

1.2.1 HPLC法花青素测定

1.2.1.1 样品制备

称取磨碎茶粉0.200 g于100 mL圆底烧瓶中，加入提取液（盐酸甲醇）20 mL，超声振荡30 min，在95℃水中水浴1 h，待冷却后，过滤在25 mL容量瓶中，重复提取2次，定容至25 mL，混匀，用0.2 μm滤膜过滤，上机，进行测定。

1.2.1.2 色谱条件

参照NY/T 2640—2014植物源性食品中花青素的测定-高效液相法[8]。色谱柱，Agilent porshell 120 ECC18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相A为0.1%甲酸；流动相B为0.1%甲酸和乙腈；检测波长530 nm；流速0.8 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μ L；HPLC洗脱程序为：0～25 min，B液从12%线性梯度增加至35%；25～25.5 min，B液从35%线性梯度增加至18%；11～25 min，B液从18%线性梯度增加至60%；25～27 min，B液由60%线性梯度增加至80% B；25.5～29.5 min，B液保持在80%；29.5～29.9 min，B液由80%降低至12%；30 min程序停止；以12% B液后运行平衡6 min。

1.2.2.1 样品制备

称取0.50 g茶树花茶磨碎样品，加入2%磷酸10 mL，加入10 mL甲醇，混合静置1 h，过滤于50 mL容量瓶，重复提取2次，定容至50 mL，混匀，用0.45 μm有机膜过滤，上机检测，每个样品重复提取2次，每个提取液重复测定3次。

1.2.2.2 色谱条件

参照建立的同时测定茶叶儿茶素、咖啡碱、没食子酸方法，应用HPLC测定茶样中儿茶素、咖啡碱内含物的含量。色谱柱为Tskgel ODs-80TM4.6 nm×250 mm，流动相A为0.261%磷酸与5%乙腈水溶液，流动相B为0.261%磷酸与80%乙腈水溶液，柱温40 ℃，检测波长280 nm，进样量2 μL；HPLC洗脱程序为：0～25 min，B液从10%线性梯度增加至75%；25.5～29.5 min，B液从75%线性梯度增加至100%；25.5～29.5 min，B液保持在100%；29.5～29.9 min，B液由100%降低至10%；30 min程序停止；以10% B液后运行平衡6 min。

1.3 数据处理

每个样品重复提取2次，每个提取液重复测定3次。以Mean±SD表示；应用SPSS 22进行方差分析，按照Duncan（D）进行两两比较，p＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 花青素的测定与比较

将提取的花青素上机检测后，测到6个样品中的6个花青素：天竺葵色素（Pelargonidin，Pg）、飞燕草色素（Delphinidin，Dp）、矢车菊色素（Cyanidin，Cy）、锦葵色素（Malvidin，Mv）、牵牛花色素（Petunidin，Pt）和芍药色素（Peonidin，Pn）；检测色谱图如图2，数据结果如表2和图3。

图2 HPLC测定花青素色谱图

表2 样品花青素含量测定 mg/g

图3 花青素含量比较

分析数据发现一芽三叶样品中花青素含量比较为：红紫芽3号（4.89±0.32 mg/g）显著高于其他（p＜0.05），红紫芽3号＞紫娟＞红紫芽2号＞红紫芽1号；成熟叶片中红紫芽4号（8.54±0.10 mg/g）显著高于红紫芽5号（6.31±0.15 mg/g），且显著高于一芽三叶样品（p＜0.05）；测定发现矢车菊素显著高于飞燕草色素、天竺葵色素及其他花青素。

2.2 儿茶素的测定与比较

将提取的儿茶素上机检测后，测到了6个样品中8个成分：表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸脂（ECG）、表儿茶素（EC）、儿茶素（C）、没食子酸（GA）、1, 4, 6-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖（GG）和咖啡碱（CA）；高效液相色谱检测色谱图如图4，检测结果如表3、表4、图5和图6。

表3 样品中儿茶素的含量测定 mg/mL

数据分析发现一芽三叶样品中儿茶素含量比较为：红紫芽1号（84.18±9.58 mg/g）显著高于其他样品（p＜0.05），红紫芽1号＞紫娟＞红紫芽2号＞红紫芽3号；成熟叶片中红紫芽4号（44.93±2.10 mg/g）高于红紫芽5号（39.83±3.39 mg/g），且显著低于一芽三叶样品（p＜0.05）；测定发现6个样品儿茶素中简单儿茶素的含量都低于酯型儿茶素含量。

图4 HPLC测定儿茶素、GA 、GG 、CA色谱图

图5 儿茶素含量比较

表4 样品GA、CA、GG含量测定 mg/g

图6 CA、GA、GG的含量比较

结果表明，一芽三叶样品中，红紫芽1号的GA含量（0.93±0.06 mg/g）显著高于其他样品；GG含量最高的是红紫芽3号，达（5.05±0.82 mg/g）显著高于其他样品（p＜0.05）；CA含量最高的是红紫芽1号，达18.10±1.19 g高于其他样品。成熟叶片的GA、GG、CA含量均显著低于一芽三叶样品（p＜0.05）。

3 讨论

高效液相色谱分析表明在红紫芽1号中没有检测到牵牛花色素，锦葵色素，其余红紫芽都检测到植物中常见的天竺葵色素（Pg）、飞燕草色素（Dp）、矢车菊色素（Cy）、锦葵色素（Mv）、牵牛花色素（Pt）和芍药色素（Pn）6种主要的花青素，花青素单体显著高的是矢车菊色素，在不同紫化程度中显著增加（p＜0.05），飞燕草色素其次含量高，这可能是红紫芽紫色加深的主要因素。

茶树中儿茶素是主要的多酚化合物，在试验中，红紫芽1号总儿茶素显著高于其他样品（p＜0.05），而紫娟和红紫芽2和3号没有显著差异，红紫芽4和5号没有显著差异，这与其花青素积累多，儿茶素积累少的分布模式总体相似，部分存在差异。酯型儿茶素在紫娟和红紫芽1、2、3号中显著高于红紫芽4、5号，提示红紫芽4和5号花青素是否较多地转化为儿茶素；而简单儿茶素（C）整体积累较少，研究尚未阐明原因，这可能受其他调节因子的影响。

试验表明没食子酸含量与儿茶素含量分布模式相似，这可能表明是酯型儿茶素含量高的重要原因。咖啡碱的生物合成与花青素分布模式相似，在紫化程度高的红紫芽茶中含量较低，这与Kerio等[20]研究相一致。缩合单宁（GG）在红紫芽4、5、6号中含量显著高于其他样品，这可能为提供花青素积累存在影响。

茶叶中内含物质的形成与外界环境密切相关，受光照，温度，土壤及生物胁迫等的影响，同时受结构基因，功能基因和激素等调控，样品采摘是在9月下旬进行，都是在一个季节完成，试验所得数据只能代表当季，所得结论存在偶然性，应继续分析每个季节样品化学物质含量，以便综合筛选优质资源，同时为花青素与儿茶素积累机制提供化合物含量方面的参考数据。红紫芽茶富含花青素，有望开发成为特种茶，因此分析同一资源圃的6个不同红紫芽茶儿茶素、花青素和咖啡碱等化学成分含量，有望发现花青素含量高的优质红紫芽茶树种质资源库，为今后培育优质茶叶品种奠定良好基础。

4 结论

试验测定比较6个红紫芽茶样品的花青素、儿茶素和咖啡碱等化合物，发现红紫芽3、4和5号花青素含量显著高于紫娟，这些紫色茶树资源将是花青素富集的健康茶饮料的潜在原材料，具有一定开发潜力，值得继续研究。