响应面优化饮料中咖啡因的前处理方法

魏陈楠，金惠玉*，陈彦凤，赵岚*

1. 黑龙江东方学院（哈尔滨 150066）；2. 黑龙江省疾病预防控制中心（哈尔滨 150036）

咖啡因是咖啡豆、茶叶等天然植物中常见的一种黄嘌呤类生物碱化合物，主要分布于植物的幼嫩组织部位，化学式C8H10N4O2，化学名称1, 3, 7-三甲基黄嘌呤（137X）[1]。咖啡因具有兴奋心脏、骨骼肌和中枢神经系统、抗氧化、舒张血管、松弛平滑肌等生理作用[2]，但大剂量或长期使用咖啡因会对人体中枢神经系统造成损害，引发心脏病和高血压，且咖啡因具有成瘾性，停用会出现浑身困乏疲软、精神萎顿、头痛、抑郁等各种戒断症状，因此咖啡因又被列入国家管制的精神药品范围[3-5]。约80%的世界人口每天都在饮用含咖啡因的产品，其中最普遍的是咖啡（71%）、软饮料（16%）和茶（12%）[6]。各国对饮料中的咖啡因都有相应标准。

饮料中咖啡因前处理技术有直接上机法、超声提取、溶剂提取、氧化镁法、超声辅助提取等[7-11]方法，但都是针对不同种饮料，而利用Box-Behnken设计-响应面优化的前处理方法适用于所有饮料中的咖啡因前处理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

咖啡因标准品（纯度大于99%，中国物质标准中心）；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，中国DiKmapure公司）；纯水（德国CNW公司）；氧化镁（天津科密欧有限公司）。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（美国Waters e2695公司）；色谱柱C18（5 μm，200 mm×4.6 mm，Diamonsil）；手动单道移液枪（200 μL，1 mL和5 mL，美国RAININ公司）；漩涡振荡器（REAX系列，德国Heidolph）；KQ-500VED型双频数超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；电子天平（CP324S德国Sartorius）；0.22 μ m、0.45 μm微孔滤水膜（中国Dikma公司）等。

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的绘制

取0.9 mg（精确至0.1 mg）标准样品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，则配制成90 μg/mL的标准储备液，然后从储备液中吸取0，25，50，100和200 μL的标定容到1 mL的进样小瓶中，在上高效液相色谱（流速1.0 mL/min，流动相V甲醇∶V水=30∶70）中进行测定，标准曲线为Y=3.15×104X-1.57×105，R2=0.999 7。

1.3.2 样品制备

取5 mL空白样品（即不含咖啡因的饮料）定容于5 mL容量瓶中，并称质量；加入300 μL的90 μg/mL咖啡因标准储备液；将溶液用振荡器混合均匀。得到5.4 μg/mL的样品溶液。

1.3.3 样品测定

将前处理之后的样品，按1.3.1的高效液相色谱条件进行测定，得出相应测定值。

1.3.4 样品回收率的计算

1.3.5 样品前处理单因素试验

1.3.5.1 超声温度对饮料中咖啡因的回收率的影响

按照1.3.2制备样品，固定超声时间20 min，氧化镁加入0.2 g，选择超声温度20，25，30，35和40 ℃。得到样品静置30 min，取清液，按照试验方法1.3.3和1.3.4对饮料中前处理的样品进行测定和回收率计算，每组试验平行做6次。

1.3.5.2 超声时间对饮料中咖啡因的回收率的影响

按照1.3.2制备样品，固定超声温度40 ℃，氧化镁加入0.2 g，选择超声时间0，10，20，30和40 min。得到样品静置30 min，取清液，按照试验方法1.3.3和1.3.4对饮料中前处理的样品进行测定和回收率计算，每组试验平行做6次。

1.3.5.3 氧化镁用量对饮料中咖啡因的回收率的影响

按照1.3.2制备样品，固定超声温度40 ℃、超声时间20 min，选择氧化镁用量0，0.2，0.5，0.8和1.1 g。得到样品静置30 min，取清液，按照试验方法1.3.3和1.3.4对饮料中前处理的样品进行测定和回收率计算，每组试验平行做6次。

1.3.6 样品前处理响应面试验

根据单因素试验的结果，利用Design-Expert的Box-Behnken试验设计，选择超声温度（A）、超声时间（B）、氧化镁质量（C）三因素三水平的响应面试验（每组试验平行做6次），考察因素及因素间交互作用对饮料中咖啡因回收率的影响，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平表

1.3.7 样品前处理试验数据处理

用Expert整理数据，将单因素试验得出的数据用Origin 85作曲线图，用Design-Expert 8.0.6设计并分析饮料中咖啡因的最佳前处理条件。

2 结果与分析

2.1 样品前处理单因素试验结果与分析

2.1.1 超声温度对饮料中咖啡因的回收率的影响

从图1可以看出，超声温度在20～35 ℃时，随着超声温度增加，咖啡因回收率逐渐增大，咖啡因回收率最大达94.8%。超声温度继续增加，咖啡因回收率开始有下降趋势，可能是温度过高使得咖啡因结构遭到破坏导致咖啡因回收率下降[12]。因此，超声温度最佳条件为35 ℃。

图1 超声温度对饮料中咖啡因回收率的影响

2.1.2 超声时间对饮料中咖啡因的回收率的影响

从图2可以看出，超声温度在0～20 min时，随着超声时间增长，咖啡因回收率逐渐增大，咖啡因回收率最大达95.12%。超声时间继续增加，咖啡因回收率基本不再改变，所以超声时间最佳条件为20 min。

图2 超声时间对饮料中咖啡因回收率的影响

2.1.3 氧化镁用量对饮料中咖啡因的回收率的影响

从图3可以看出，氧化镁用量在0～0.2 g时，随着氧化镁用量增加，咖啡因回收率逐渐增大，咖啡因回收率最大达95.2%。氧化镁用量继续增加，咖啡因回收率开始降低，因此氧化镁用量最佳条件为0.2 g。

图3 氧化镁用量对饮料中咖啡因回收率的影响

2.2 样品前处理响应面试验结果与分析

根据单因素试验的结果，利用Design-Expert的Box-Behnken试验设计，选择超声温度（A）、超声时间（B）、氧化镁用量（C）三因素三水平的响应面试验，共17组试验，从而得到对饮料中咖啡因前处理的最佳条件，见表2。

表2 响应面试验设计与结果

2.2.1 咖啡因回收率回归模型的建立和方差分析

利用Design-Expert 8.0.6软件对表3所得数据进行响应面试验分析，以咖啡因的回收率（Y）为响应值，对各因素超声温度（A）、超声时间（B）、氧化镁用量（C）为变量分别进行二元多次回归方程分析，二元多次方程为：Y=95.70+5.70A-0.92B-1.53C-1.96AB+1.36AC-1.51BC-4.50A2-4.4B2-5.09C2。由表3回归方程的方差分析结果可知，试验模的F值为57.85，p＜0.000 1，该试验模型已经达到极显著水平，则说明该二项式方程与实际回收情况拟合关系很好，证明咖啡因的回收率与超声温度、超声时间、氧化镁质量关系良好；该二项式方程决定系数R2=0.986 7，说明饮料中咖啡因的回收率与预测值非常接近，拟合度高和该回归模型可靠性高，同时校正后修复系数R2adj=0.969 7，说明有96.97%的响应值变化可以被模型接受。次变异系数C.V=1.23%，说明该回归模型的置信度较高，试验的可靠性和精确度较好；方程的失拟项F值为5.16，p=0.073 4＞0.05，表示该回归模型的失拟度不显著，表明影响饮料中咖啡因前处理时回收咖啡因的未知因素对试验结果干扰较小，说明该回归模型的预测值与试验值能有较好的吻合度，所以可用模型来分析和预测饮料中咖啡因前处理之后咖啡因回收率的大小。

由表3可知p值大小，A对咖啡因回收率极具显著性，B、C具有显著性，A和B、A和C、B和C具有显著性。由表3可知F值大小，3个因素对咖啡因回收率的影响显著程度排序为A＞C＞B，并且各试验因素交互作用对咖啡因回收率的影响强弱依次为AB＞BC＞AC。因此，该二元多次方程较好描述咖啡因回收率随着各种因素的变化规律，具有良好的分析和预测指导性。

表3 咖啡因含量方差分析

2.2.2 咖啡因回收率响应面和等高线图分析

根据二项式数学模型，应用Design-Expert 8.0.6软件，绘制考察指标与影响较显著的两个自变量的三维响应面图和二维等高线图，可以直观地反映各因素对效应值的影响，每个效应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素固定在零水平上。从试验所得的三维响应面图上可以看出它们在反应过程中的相互作用，如图4所示。

由图4三维响应面图及二维等高线图可直观观察各因素及各因素之间关系，等高线表现为椭圆形或效应面倾斜度陡峭，说明该因素对咖啡因回收率的影响越显著，等高线越密集表明该因素对咖啡因回收率的影响效果越大；等高线表现为偏圆形或效应面倾斜度平滑，则说明该因素对咖啡因回收率的影响不显著，等高线越稀疏表明该因素对咖啡因回收率的影响效果越小。各影响因素对咖啡因回收率的影响不是简单的线性关系，各等高线呈椭圆形或圆形，效应面倾斜度较陡峭，表明两试验因素间的相互影响较为显著。从二维等高线上看，在超声温度35 ℃、超声时间20℃、氧化镁用量0.2 g附近值时，对提高咖啡因回收率有重要影响。

结合三维响应面图和二维等高线图分析可知，各试验因素的主次顺序为A＞C＞B。

2.2.3 咖啡因回收率最佳条件的选取及验证试验

根据回归模型，利用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行分析，见图5得到饮料中咖啡因前处理的最优化条件为：超声温度38.43 ℃、超声时间17.48 min、氧化镁用量0.2 g，咖啡因回收率预测值为97.78%。考虑到实际操作的可行性，将优化条件修正为：超声温度38 ℃、超声时间18 min、氧化镁用量0.2 g。根据预测得出的最优提取工艺条件，平行进行6次验证试验，咖啡因回收率分别为96.12%，97.03%，96.88%，96.52%，98.29%和96.90%，平均值为96.91%，即回收率为96.91%±0.75%，与预测值的相对误差为-0.84%，表明所建立的数学模型具有准确的预测性，所选前处理条件具有较好重现性。

图4 因素交互作用对咖啡因回收率的影响

图5 数值优化法试验结果

3 结论

优化前处理方法，基于单因素试验，利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behnken试验设计法对饮料中咖啡因前处理因素进行设计和优化。结果表明，A和B、A和C、B和C这3种交互作用对咖啡因的回收率均有显著性影响。利用响应面分析方法所建立的数学模型对前处理条件优化的结果为：超声温度38 ℃、超声时间18 min、氧化镁用量0.2 g。在此条件下得到咖啡因回收率为96.91%±0.75%，与预测值一致，从而确定饮料中咖啡因前处理的最佳条件。该前处理方法简便，精确度高，可预测性好，适用于各类饮料，为进一步开发饮料中咖啡因的前处理方法提供科学依据和试验基础。