白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肝损伤的保护作用

柏海涛 陈文兵 刘欢

脓毒症(sepsis)是临床常见的急危重症，急性肝损伤( acute liver injury，ALI)是脓毒症最早见的靶器官损伤[1]，炎症因子的大量激活是脓毒症患者器官损伤的主要机制，急性肝损伤也与炎症因子的过度激活密切相关[2]，抑制炎症反应保护肝功能在脓毒症的治疗中已经被证实[3]。核因子 κB( nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路是脓毒症炎症因子激活释放的主要调节通路[4]，白藜芦醇(Resveratrol，Res)是多酚类化合物，主要来源于花生 、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有抗炎、抗氧化的作用，可以作为动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂[5]。本研究观察白藜芦醇对脓毒症大鼠急性肝损伤的保护作用，并探讨NF-κB炎性通路在其中的可能作用。

资料与方法

一、实验材料和方法

健康雄性SD大鼠购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，体质量210 ～ 240 g，共 40只，在动物中心清洁级适应性喂养3 d后，进行后续实验造模和研究。

二、方法

(一)脓毒症造模 40只SD大鼠随机分为假手术组(10只)和造模组(30只)，盲肠结扎穿刺术制作脓毒症大鼠实验模型。简述如下：备皮消毒后，30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，沿腹正中线做1.5 cm切口，找到盲肠，游离肠系膜，距盲肠末端1/3处用 4 号手术线结扎，穿刺盲肠肠管，将盲肠还纳腹腔，关闭腹腔，术后皮下注射生理盐水抗休克治疗。10只假手术组大鼠仅仅分离盲肠，不做结扎和穿孔。术后30只造模SD 大鼠随机分为脓毒症模型组和白藜芦醇干预组，每组15只，白藜芦醇干预组大鼠于术后60 min尾静脉注射无菌白藜芦醇(40 mg/kg，美国sigama公司产品)，假手术组和脓毒症模型组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。24 h后进行相关指标检测。

(二)外周血总胆红素(TBil)、谷草转氨酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的ELISA法检测

大鼠外周血TBil、AST、ALT、TNF-α、IL-6表达使用ELISA法检测。ELISA检测试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司(批号：20180514、20180418、20180522、20180407、20180523)，造模前和造模24 h后抽取大鼠尾静脉血液0.4 mL，交由检验科严格按照试剂盒说明书操作，加入相关试剂，上海巴玖实业有限公司SAF-680T酶标仪检测各样品的吸光度值变化，对照标准品，计算各样品TBil、AST、ALT、TNF-α和IL-6的表达水平。

(三)肝组织细胞细胞核P65的Western blot检测 造模24 h后，所有大鼠均断颈处死，取50 mg肝组织，液氮下研磨后，PBS洗涤2次，细胞核蛋白提取CelLyticTMNuCLEARTM试剂盒购自美国sigma公司(批号：20180422)，严格按照试剂盒说明书操作，提取细胞核蛋白，加入蛋白裂解液，取10 μg核蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后电转至PVDF膜，加入兔抗鼠P65抗体(购自上海康成生物工程有限公司，批号：201800317)孵育12 h，加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗(购自美国sigma公司，批号：201800226)，化学发光后使用Quantity One V4.3.0软件，扫描条带，以组蛋白为内参计算各样品的相对表达量。

三 、统计分析

选用SPSS 18. 0软件进行统计学分析，计量资料采用t检验，多组均数比较使用方差分析，组间相互比较使用LSD-t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、三组造模后存活率比较

假手术组无大鼠死亡，存活率为100.0%，脓毒症模型组死亡6只，存活9只，存活率为60.0%，白藜芦醇干预组死亡4只，存活11只，存活率为73.3%，三组间存活率具有显著性差异(P<0.05)。

二、三组大鼠肝功能指标的比较

造模前三组TBil、AST和ALT表达水平无显著性差异(P>0.05)，造模24 h后假手术组TBil、AST和ALT无显著性变化(P>0.05)，脓毒症模型组和白藜芦醇干预组TBil、AST和ALT均显著升高(P<0.01)，但白藜芦醇干预组TBil、AST和ALT均显著低于脓毒症模型组(P<0.01)。见表1。

三、三组大鼠TNF-α、IL-6表达的比较

假手术组、脓毒症模型组和白藜芦醇干预组造模前外周血TNF-α和IL-6表达无显著性差异(P>0.05)，造模24 h后假手术组TNF-α和IL-6表达显著低于白藜芦醇干预组(P<0.01)，白藜芦醇干预组TNF-α和IL-6表达又显著低于脓毒症模型组(P<0.01)。见表2。

四、三组造模24 h后肝组织细胞细胞核P65的表达

肝组织细胞核P65相对灰度值在假手术组、脓毒症模型组和白藜芦醇干预组为0.22±0.05、0.48±0.11、0.34±0.07，各组间具有显著性差异(P<0.01)。其中假手术组肝组织细胞细胞核P65表达显著低于白藜芦醇干预组，白藜芦醇干预组又显著低于脓毒症模型组。

讨 论

脓毒症激发的全身炎症综合征是伴发多器官功能障碍的重要原因[6]，研究已发现脓毒症急性肝损伤患者体内炎症反应的激活[7]，NF-κB信号通路是机体内一条重要的炎性调节通路[8]，在脓毒症时处于激活状态，并且可以参与到肝损伤的致病过程中，李徽徽等[9]的实验研究显示抑制NF-κB信号通路可以对抗大鼠脓毒症导致的急性肝损伤。白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，其抗炎作用已被大多数实验所证实[10]，研究显示白藜芦醇可以显著降低氧化应激、内质网应激以及炎症反应，对急性肝损伤小鼠发挥保护作用[11]。本研究也观察到了白藜芦醇干预组肝功能指标显著低于脓毒症模型组，说明了脓毒症时给予白藜芦醇对模型鼠肝组织具有保护作用。

表1 三组TNF-α和IL-6表达的比较

注：与假手术组比较,**P<0.01；与脓毒症模型比较,▲▲P<0.01。造模24h后与造模前比较,##P<0.01

表2 三组TNF-α和IL-6表达的比较

注：与假手术组比较,**P<0.01；与脓毒症模型比较,▲▲P<0.01。造模24 h后与造模前比较,##P<0.01

NF-κB信号通路中的主要效应蛋白是P65和P50，二者形成二聚体进入细胞核发挥转录因子的作用，调节下游炎性因子例如TNF-α和IL-6 等的表达，因此研究中检测细胞核中P65蛋白的表达就可以反应出NF-κB信号通路的激活情况[12]。本研究的检测显示模型组大鼠肝组织细胞核P65表达显著高于假手术组，其中白藜芦醇干预组肝组织细胞细胞核P65表达显著低于非干预的脓毒症模型组，说明了白藜芦醇抑制了NF-κB信号通路中关键蛋白P65的核移位，下游的炎症因子TNF-α和IL-6也相应的在白藜芦醇干预组显著低于脓毒症模型组。综合上述研究提示了白藜芦醇对脓毒症大鼠肝损伤的保护作用可能是通过调节NF-κB通路来实现的，但是其具体的机制还需要进一步实验来证实。