HBx介导SOCS-1基因甲基化致肝细胞癌发生的机制

龙云铸 贺萧瑾 李丹 周娟 周青 谭英征

肝细胞癌(HCC)是临床上常见的恶性肿瘤，我国HCC的发生与HBV感染关系密切[1]。HBV是由双链DNA构成的病毒，包含四个重叠的编码基因区域，其中，HBV X基因(HBx基因)可通过抑制抑癌基因的表达而导致HCC的发生[2]，但HBx基因发挥作用的具体机制仍不清楚。在多种抑癌基因中，细胞因子信号转导抑制蛋白-1(SOCS-1)基因发挥重要的调控作用，SOCS-1基因启动子区域甲基化可促进多种肿瘤细胞的增殖和转移[3]。我们推测HBx基因可能通过抑制SOCS-1基因表达而起作用。本研究主要利用细胞转染及甲基化PCR技术，探究HBx介导SOCS-1基因甲基化致HCC发生的机制。

资料与方法

一、材料

(一)细胞系 人正常肝细胞系L-02，购于通派生物科技有限公司。

(二)主要试剂 胎牛血清、MEM培养基(Gibco Life Technologies)；HBx质粒(上海吉玛制药有限公司)；MTT细胞活力检测试剂盒、SYBR Green qPCR Mix试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；Transwell小室(美国康宁公司)；RNA逆转录试剂盒、SOCS-1基因甲基化扩增试剂盒、引物序列合成(上海杰美基因医药科技有限公司)，见表1；小鼠抗人HBX单抗、小鼠抗人SOCS-1单抗、兔抗小鼠二抗(圣克鲁斯生物技术有限公司)。

(三)主要仪器 细胞培养箱(上海培因实验仪器有限公司)；酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)；实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

二、方法

(一)细胞培养 将L-02细胞使用含10%胎牛血清的MEM培养基，放置在无菌培养箱中常规培养，培养温度为37 ℃，CO2浓度为5%，每4天传代一次。

(二)细胞分组及细胞转染 (1)细胞分组：在进行转染前，将培养在96孔板或6孔板的细胞分为对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组。(2)细胞转染：当L-02细胞汇合度达到60%时，取2个2 mL无菌EP管，加入250 μL MEM培养基，再加入7 μL Lipofectamine 2 000，轻轻混匀。在这两个EP管中分别加入3 μL空载质粒、3 μL HBx质粒，轻轻混匀，静置20 min。将含有3 μL空载质粒的混合液加入空载质粒转染组，将含有3 μL HBx质粒的混合液加入HBx质粒转染组，对照组细胞中只加入与其他两组体积相同的MEM培养基，培养6 h后，将培养液换成含10%胎牛血清的MEM培养基，再培养24 h后进行相关实验。

(三)MTT法检测细胞增殖能力[4](1)将L-02细胞按5×103个/孔的数目接种于96孔板中，24 h后，按方法(二)步骤进行处理。(2)将96孔板中的细胞培养液吸取干净，每孔加入20 μL MTT溶液，放置在培养箱中孵育4 h。(3)将96孔板中液体倒掉，每孔加入150 μL DMSO溶液，震荡5 min，使紫色反应产物彻底溶解。(4)将酶标仪检测波长设置为490 nm，上机测定各组细胞的吸光度(OD)，细胞OD值越大，细胞增殖能力越强，实验重复6次。

(四)Transwell小室法检测各组细胞迁移能力[5](1)将L-02细胞按3×104个/孔的数目接种于6孔板中，培养24 h，按方法(二)步骤对细胞进行处理。(2)取出6孔板，加入0.25%胰酶消化细胞，各组细胞经离心后，加入MEM培养基重悬细胞。(3)对离心管中的细胞计数，并调整离心管中的细胞浓度(细胞浓度为1.5×105个/mL)。(4)从离心管中吸取100 μL细胞悬液，加入Transwell小室中，置入培养箱培养12 h。(5)固定：取出小室后，使用95%乙醇溶液将细胞固定15 min。(6)染色：将0.1%的结晶紫溶液滴加在细胞表面，使细胞全部浸在染液中，10 min后，使用PBS对细胞清洗3次，晾干。(7)观察计数：用倒置显微镜进行观察，随机选取5个视野计算穿过膜的细胞数，穿过膜的细胞数越多，细胞迁移能力越强，重复6次。

表1 引物序列

(五)RT-qPCR法检测各组细胞HBX mRNA及SOCS-1 mRNA水平 (1)将L-02细胞接种于6孔板中，按方法(二)步骤进行转染。(2)收集各组细胞，添加TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，随后对总RNA进行逆转录。(3)按照试剂盒方法配制Mix及反应体系。(4)对cDNA进行扩增，扩增条件为：95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共计50个循环反应。(5)采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，实验重复6次。

(六)Western blot法检测各组细胞中HBX及SOCS-1蛋白水平 (1)将L-02细胞接种于6孔板中，按方法(二)步骤进行转染。(2)收集各组细胞，加入细胞裂解液，使用超声破碎仪裂解细胞，经低温高速离心后，使用BCA蛋白定量试剂盒调整蛋白浓度。(3)上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，使用2% BSA溶液封闭。(4)在4 ℃条件下孵育小鼠抗人HBx单抗(1∶1 000)及小鼠抗人SOCS-1单抗(1∶1 000)。(5)12 h后，在室温条件下，孵育兔抗小鼠二抗(1∶5 000)，孵育2 h。(6)在凝胶成像仪中成像拍照，使用Image J软件进行分析，实验重复6次。

(七)甲基化PCR法检测各组细胞SOCS-1基因甲基化水平[6](1)将L-02细胞接种于6孔板中，按方法(二)步骤进行转染。(2)收集并提取各组细胞总DNA。(3)使用甲基化扩增试剂对SOCS-1基因的甲基化(M)引物及非甲基化(U)引物进行扩增。扩增条件：95 ℃变性45 s， 60 ℃退火50 s， 72 ℃延伸60 s，共计40个循环反应。(4)配制2%琼脂糖凝胶，对PCR扩增产物进行电泳，使用UVP凝胶成像仪拍照。(5)使用Image J软件分析SOCS-1基因甲基化水平，实验重复6次。(6)按照下列公式计算SOCS-1基因甲基化水平。公式：SOCS-1基因甲基化水平=灰度值M/(灰度值M+灰度值U)。

三、统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料均服从正态分布，结果以均数±标准差表示。多组间均数的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用S-N-K检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、各组细胞增殖能力比较

对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组细胞的OD值分别为0.48±0.12、0.50±0.14、0.88±0.13，差异具有统计学意义(F=21.07，P<0.001)。空载质粒转染组与对照组细胞OD值比较，差异无统计学意义(q=0.4073，P>0.05)。HBx质粒转染组细胞OD值高于空载质粒转染组(q=7.7388，P<0.05)。

二、各组细胞迁移能力比较结果

对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组穿过小室膜的细胞数目分别为148.31±6.92、151.27±8.22、229.18±11.37，差异具有统计学意义(F=154.68，P<0.001)。其中，空载质粒转染组与对照组穿过小室膜的细胞数目相比，差异无统计学意义(q=0.8028，P>0.05)。HBx质粒转染组穿过小室膜的细胞数目多于空载质粒转染组(q=21.1293，P<0.05)。

三、各组细胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比较结果

对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组细胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比较，差异具有统计学意义(F=95.29、26.95，P<0.01)。空载质粒转染组与对照组细胞中HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比较，差异均无统计学意义(q=0.304 6、0.315 4，P>0.05)。HBx质粒转染组细胞中HBx mRNA水平高于空载质粒转染组(q=17.057 8，P<0.05)，HBx质粒转染组细胞中SOCS-1 mRNA水平低于空载质粒转染组(q=9.145 2，P<0.05)。

A：对照组，B：空载质粒转染组，C：HBx质粒转染组

图1各组细胞迁移能力(×100)

表2 各组细胞HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平比较结果(n=6)

注：与对照组相比，aP<0.05；与空载质粒转染组相比，bP<0.05

四、各组细胞中HBX及SOCS-1蛋白水平比较

各组细胞HBX及SOCS-1蛋白水平比较，差异具有统计学意义(F=149.88、154.74，P<0.01)。空载质粒转染组细胞内HBX及SOCS-1蛋白水平与对照组比较，差异均无统计学意义(q=0.226 8、1.923 7，P>0.05)。HBx质粒转染组细胞内HBX蛋白水平高于空载质粒转染组，差异有统计学意义(q=21.090 4，P<0.05)。HBx质粒转染组细胞内SOCS-1蛋白水平低于空载质粒转染组(q=22.442 8，P<0.05)。

A：对照组，B：空载质粒转染组，C：HBx质粒转染组

图3各组细胞中HBX及SOCS-1蛋白水平

表3 各组细胞中HBX及SOCS-1蛋白水平比较结果(±s, n=6)

注：与对照组相比，aP<0.05；与空载质粒转染组相比，bP<0.05

五、各组细胞SOCS-1基因甲基化水平比较

对照组、空载质粒转染组、HBx质粒转染组细胞SOCS-1基因甲基化水平分别为0.23±0.09、0.21±0.08、0.88±0.11，差异具有统计学意义(F=98.32，P<0.001)。空载质粒转染组与对照组细胞SOCS-1甲基化水平比较，差异无统计学意义(q=0.520 3，P>0.05)。HBx质粒转染组细胞SOCS-1甲基化水平高于空载质粒转染组，差异有统计学意义(q=17.428 9，P<0.05)。

A：对照组；B：空载质粒转染组；C：HBx质粒转染组

图4各组细胞SOCS-1基因甲基化水平比较结果

讨 论

本研究将HBx质粒转入L-02细胞内后，L-02细胞的增殖、迁移能力均明显增强。HBx基因对L-02细胞增殖迁移能力的影响与HBx基因对HCC细胞的影响一致。研究者继续对L-02细胞中SOCS-1基因的表达水平进行检测。RT-qPCR结果显示，经HBx质粒转染后的L-02细胞内HBx mRNA水平升高、SOCS-1 mRNA水平降低。Western blot实验表明，经HBx质粒转染的L-02细胞内HBX蛋白水平上升、SOCS-1蛋白水平降低，HBX及SOCS-1蛋白水平的变化与HBx mRNA及SOCS-1 mRNA水平变化情况一致。上述结果表明，HBx基因可以通过促进SOCS-1基因启动子发生甲基化，抑制L-02细胞内SOCS-1基因的表达。本研究通过甲基化PCR法检测了各组细胞中SOCS-1基因启动子甲基化水平，结果显示，经HBx质粒转染的L-02细胞中SOCS-1基因启动子甲基化水平明显升高。

综上所述，L-02细胞经HBx质粒转染后，细胞中HBx mRNA水平和SOCS-1基因启动子甲基化水平升高，SOCS-1 mRNA及SOCS-1蛋白表达水平降低，L-02细胞增殖、迁移能力异常增强，从而导致HCC发生。但本研究仅从细胞水平进行了相关研究，在未来的研究中，我们将会利用动物实验对HBx基因、SOCS-1基因甲基化及HCC三者的关系进行研究。