miR-122在糖尿病合并慢性乙型肝炎患者中的表达及临床意义研究*

朱杰华，王江林，丰智雪，陈安林，黄 健，杜文胜△

1.遵义医科大学附属医院医学检验科，贵州遵义 563000；2.贵州省仁怀市中医院检验科，贵州仁怀 564500；3.遵义医科大学医学与科技学院，贵州遵义 563099

乙型肝炎是目前最常见的慢性传染病，有着相当高的发病率和病死率。据世界卫生组织报道，我国慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者约9 300万，其中慢性乙型肝炎患者约2 000万，每年约有100万人死于HBV导致的肝衰竭、肝硬化及肝癌。糖尿病(DM)是最常见的慢性代谢性疾病，目前全世界的DM患者已达2.46 亿[1]，而由DM引起的心脑血管、视网膜、肾脏、神经损伤等可加重患者的病情，严重影响患者的治疗和预后[2-4]。微小RNA-122(miR-122)是微小RNA(microRNA)家族的一员，参与机体的新陈代谢，免疫功能，细胞增殖、凋亡，组织生长及分化等过程[5]。研究认为DM可以通过影响肝脏对脂肪的代谢，间接影响肝细胞内miR-122的表达，进而影响肝细胞的生物学功能[6]。在肝细胞中，miR-122不仅对肝细胞的生长周期、脂肪代谢等肝脏生理功能具有重要调节作用，而且与病毒性肝炎关系密切[7]。此外，临床发现DM会增加HBV感染的风险，但miR-122在DM合并HBV感染中的具体作用和可能机制目前尚不明确。本文通过对DM患者、慢性乙型肝炎患者、DM合并慢性乙型肝炎患者外周血标本miR-122水平的分析，探讨了miR-122在不同患者中的差异性表达情况及其与临床生化指标间的关系，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年7月到2017年8月于遵义医科大学附属医院内分泌科和感染科住院治疗的患者125例为研究对象，其中临床明确诊断的DM患者(DM组)50例，男27例、女23例，年龄11～78岁、平均(34.5±10.40)岁；慢性乙型肝炎患者(HBV组)50例，其中男30例、女20例，年龄14～58岁、平均(31.58±10.03)岁；DM合并慢性乙型肝炎患者(DM合并HBV组)25例，其中男11例、女14例，年龄17～73岁、平均(34.58±11.31)岁。随机挑选同期于该院健康体检者20例为对照组，其中男14例、女6例，年龄21～38岁、平均(28±8.5)岁。纳入标准：DM组患者均符合DM诊断标准；HBV组患者均符合慢性乙型肝炎诊断标准；DM合并HBV组患者均同时符合DM及慢性乙型肝炎诊断标准。排除标准：合并其他慢性代谢性疾病、脂肪肝、药物性肝炎、自身免疫性疾病、感染性疾病和遗传性疾病的患者；合并严重心脑肾等重要脏器功能障碍的患者；合并精神障碍的患者。4组研究对象性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有受试者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2仪器与试剂 奥林巴斯AU5400全自动生化仪、雅培i2000化学发光检测仪、全自动糖化血红蛋白检测仪、实时荧光定量PCR仪、生物安全柜、低温高速离心机等。试剂包括RNA提取试剂盒、DNA提取试剂盒及反转录试剂盒等。

1.3方法

1.3.1总RNA提取 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次收集沉淀；RNA的提取严格按试剂盒说明书进行，取3 μL RNA用1.2%琼脂凝胶电泳检测，余RNA于-20 ℃保存待用。

1.3.2反转录 按试剂盒说明书进行反转录体系配制，2×反转录缓冲液10 μL，反转录引物1.2 μL，RNA 2 μL，MMLV反转录酶0.2 μL，加入DEPC至总体系体积为20 μL，反应条件为42 ℃ 15 min，85 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。

1.3.3实时荧光定量检测 以U6作为内参基因，采用实时荧光定量PCR技术检测miR-122的表达水平，其反应体系为2×定量PCR Master Mix 10 μL，上游引物0.08 μL，下游引物0.08 μL，cDNA模板2 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，ddH2O加至20 μL。反应条件为95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 min，40个循环。miR-122的表达水平计算：用2-ΔΔCt代表miR-122的表达水平，其中Ct值是指从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

1.3.4生化指标检测 所有研究对象抽取空腹静脉全血3 mL，静置30 min后,3 000 r/min离心10 min,分离血清，待测。采用草酰乙酸脱氢酶法检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平；采用己糖激酶法检测血糖(GLU)水平；采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA水平。

1.4观察指标 比较各组miR-122的表达水平；比较各组生化指标(ALT、AST、GLU)及HBV-DNA水平；进一步行相关性分析明确各组miR-122表达水平与ALT、AST、GLU、HBV-DNA水平的相关性。

2 结 果

2.1各组miR-122表达水平比较 以U6作为内参，分析各组的miR-122表达水平，结果显示：对照组miR-122表达水平低于HBV组、DM 组和DM合并HBV组，差异均有统计学意义(P<0.05)；DM合并HBV组miR-122表达水平高于HBV组、DM组和对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组miR-122表达水平比较

注：与对照组比较，#P<0.05；与DM合并HBV组比较，*P<0.05。

2.2各组生化指标水平比较 HBV组HBV-DNA水平高于DM合并HBV组，差异有统计学意义(P<0.05)；DM组和DM合并HBV组GLU水平高于对照组和HBV组，差异有统计学意义(P<0.05)；HBV组ALT和AST水平高于对照组、DM组和DM合并HBV组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组生化指标水平比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与HBV组比较，△P<0.05；与DM组比较，#P<0.05。

2.3各组miR-122水平与ALT、AST、GLU、HBV-DNA水平的相关性分析 对照组miR-122水平与GLU、AST、ALT、HBV-DNA水平均无显著相关性(P>0.05)；HBV组miR-122水平与AST、ALT水平呈正相关(r=0.287、0.292，P<0.05)；DM组miR-122水平与GLU水平呈正相关(r=0.350，P<0.05)；DM合并HBV组miR-122水平与HBV-DNA、GLU水平呈正相关(r=0.238、0.231，P<0.05)。

3 讨 论

DM是最常见的代谢性疾病之一，其发病受多种因素的影响，有研究认为microRNA可能参与了DM的发病，同时还与DM相关并发症有关。邓仁生等[8]发现DM患者miR-126、miR-28-3p水平显著升高，并可能通过参与调控胰岛素及其受体信号通路和血管生成等导致DM的发生。周燕等[9]则发现2型DM患者中miR-217水平升高，并与沉默调节因子和缺氧诱导因子存在相关性，可促进DM肾损害的发展。另外，也有研究发现miR-29可通过调节靶基因PKR结合蛋白X的表达，参与DM视网膜病变的发生[10]。miR-135b可通过调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化[11]。由此可见，microRNA在DM的发生、发展过程中发挥着重要作用。既往关于miR-122与DM的相关性研究发现，miR-122与血脂水平具有相关性，其可通过下调胆固醇7-羟化酶α的基因表达，抑制胆固醇向胆汁酸转化，最终使血浆胆固醇水平升高[12]，此外，阻断miR-122表达可下调几种与三酰甘油合成相关基因的表达，从而减少肝脏三酰甘油的合成，降低血浆中三酰甘油水平[13]。

在肝脏中,miR-122与肝细胞的生长周期、脂肪代谢等生理过程有关，同时还参与病毒性肝炎的发病[7]。一方面，HBV可以利用宿主细胞内的microRNA来改变宿主细胞环境，使其有利于自身存活；另一方面，HBV可以编码microRNA来协助自身的生存和增殖。有研究发现，miR-122在HBV感染者中表达水平升高，并参与肝纤维化的发生[14]。而体外细胞实验发现miR-122的过量表达可抑制HBV的复制[15]。然而，有研究也发现，虽然慢性HBV感染引起肝脏损伤时会检测到miR-122水平的升高，但血浆中miR-122水平与HBeAg、HBV-DNA 水平均无明显相关性[16]。临床工作发现DM患者HBV的感染风险升高[17-18]，同时，DM还会引起脂肪代谢异常，导致肝细胞脂质沉积、脂肪病变，进一步加重肝损伤[19]。SCHILLIE等[17]的研究结果表明，DM患者的HBV感染率是非DM人群的1.6倍；REILLY等[18]调查发现，11.0%的急性HBV感染患者同时患有DM。miR-122既与HBV感染有关又参与DM发病，但其在DM合并慢性HBV感染中的作用及其在临床诊断、治疗中的意义目前尚不明确。

为了进一步探讨miR-122在DM合并慢性HBV感染中的作用及临床价值，本研究对DM患者、慢性乙型肝炎患者、DM合并慢性乙型肝炎患者外周血标本中miR-122的表达水平进行分析发现，miR-122在HBV组、DM组、DM合并HBV组的表达水平均高于对照组。且DM合并HBV组的miR-122水平显著高于HBV组和DM组。提示DM患者存在miR-122的水平升高，当合并HBV感染时，其miR-122水平升高更为显著。进一步对DM合并HBV组中miR-122水平与生化指标进行相关性分析发现，DM合并HBV组患者的miR-122水平与GLU、HBV-DNA水平呈正相关，推测miR-122可能参与了DM合并慢性乙型肝炎患者疾病的发生与发展过程。此外，4组间生化指标比较发现，HBV组HBV-DNA水平显著高于DM合并HBV组，考虑与miR-122在DM合并慢性乙型肝炎患者中过量表达对HBV具有负向调控作用相关[15]。但相关性分析发现，HBV组的HBV-DNA水平与miR-122水平无明显相关性，考虑可能与纳入的病例数较少，数据存在偏倚有关。

综上所述，miR-122的表达水平在DM合并慢性乙型肝炎患者中明显升高，其可能参与了疾病的发生、发展过程，但具体的分子机制目前尚不明确，有待进一步研究。