芎归不忘散对脑缺血大鼠学习记忆障碍及其线粒体、PI3K/Akt信号通路作用机制研究＊

付 颖，文 雯，魏江平，陈 欢，文跃强，徐世军＊＊

（1. 成都中医药大学药学院 成都 611137；2. 成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所成都 611137；3. 成都中医药大学基础医学院 成都 611137）

线粒体作为细胞有氧呼吸的主要场所，在细胞能量代谢中起重要作用。线粒体结构和功能的完整是维持氧化磷酸化及产生ATP 的先决条件[1-2]。线粒体对脑缺血缺氧异常敏感，缺血缺氧会使大脑葡萄糖摄入减少，线粒体呼吸链复合物活性下降，功能障碍甚至结构损伤，进而导致脑内产能不足[3-4]，可直接诱导神经元凋亡或坏死进而导致。血管性痴呆（vascular dementia，VD）指是由缺血缺氧引起的脑血管病变所致的学习及记忆功能下降[5-6]。线粒体损伤是VD 的重要病理特征，也是加重脑血管损伤和记忆障碍的重要环节。因此，保护线粒体结构和功能完整，维持脑能量供应，增强缺血缺氧受损区域对缺氧条件的耐受力，以维持神经细胞的存活在VD 防治中具有重要地位。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidyl alcohol kinases/protein kinase B，PI3K/AKT)信号通路不仅与细胞能量代谢密切相关，而且在线粒体结构和功能完整方面发挥着重要作用[9-10]。芎归不忘散(XGBWS)是由加味芎归汤与开心散组合而成，具补心益智，行气活血的功效，现有研究表明加味芎归汤和开心散单独使用对阿尔茨海默症及VD 均具有一定的治疗作用[11-12]。然而，关于加味芎归汤与开心散进行合方用于治疗痰淤酿毒，毒损脑络所致的VD 还尚未报道，故本研究拟探索两者合方后对VD 的治疗作用及其对PI3K/AKT信号与线粒体保护的影响。

1 材料与仪器

1.1 药物

川芎、当归、黄芩、石菖蒲、茯苓、远志、人参均购于成都中医药大学附属医院，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为符合药典标准，剂量比例根据中国ZL201310128021.7 加味芎归汤与《备急千金药方》开心散确定，药材用8 倍量的纯净水浸泡1 h 后煎煮3次，每次煎煮1 h，合并煎液，过滤，合并药液并浓缩至325ML 得率为32.5%浓度即为0.23 g⋅ml-1，4℃保存。甲磺酸双氢麦角毒碱片（喜得镇），天津华津制药有限公司，批号：7C883T。

1.2 动物

60 只SD 大鼠，雄性，SPF 级，体重180-220 g，于成都达硕实验动物有限公司购买，实验动物合格证编号：NO.51203500003215。

1.3 试剂

ATP(1001665433，sigma)；ADP(1001726877，sigma)；AMP(101606467，sigma)；Mitochondrial Membrane Potential DetectionJC-1 Kit（551302，BD）；PI3K Rabbit mAb（4257S，Cell Signaling Technology）；AKT Rabbit mAb（4685S，Cell Signaling Technology）；p-PI3K Antibody（4228S，Cell Signaling Technology）；p-AKT Rabbit mAb（4060S，Cell Signaling Technology）；PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT抗体稀释比例均为1∶1000。

1.4 主要仪器

Morris 水迷宫分析系统（WMT-100，成都泰盟科技有限公司），高效液相色谱仪（1260，Agilent），流式细胞仪（ZE5，Bio-Rad 公司），Champchemi 610Plus 全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），ODSHYPERSIL C18色谱柱（thermo）。

2 方法

2.1 模型制备及分组

采用微血栓栓塞法制备VD 大鼠模型[12]。待模型大鼠恢复2 周后，根据“Y”迷宫结果筛选出记忆障碍大鼠随机分成4 组，每组10 只，分别为模型组(Model)、喜得镇组(Hydergine，0.7mg/kg）、芎归不忘散高剂量组(XGBWS H，2.12g⋅kg-1）、芎 归 不 忘 散 低 剂 量 组（XGBWS L，1.06 g⋅kg-1），每组10只。另取10只假手术大鼠作为假手术对照组（Sham），按10 g⋅kg-1，每日1次，给予对应药物45 天，其中假手术对照组和模型对照组给予相应量的生理盐水。本论文的给药剂量配伍比例是源自于中国ZL201310128021.7 加味芎归汤与《备急千金药方》开心散公开的剂量配比，同时参照《中国药典》药材使用量确定本论文的大鼠给药剂量，本论文的给药时间是结合前期的工作基础及已发表论文“开心散对多发梗死性痴呆大鼠学习记忆功能及ATP/AMP的影响”确定给药时间。

2.2 大鼠学习记忆和海马病理形态学检测

参考文献[13]进行定向航行和空间探索实验，记录动物逃避潜伏期和穿越平台次数；空间探索测试结束后于无菌环境处死大鼠，于冰上分离海马，用4%多聚甲醛固定海马，常规脱水、包埋、切片、HE 染色、封片，显微镜下观察海马CA1神经元病理形态学。

2.3 海马线粒体肿胀度、膜电位和能荷检测

采用流式细胞仪检测线粒体肿胀度和膜电位[13]。取适量海马制成细胞悬液，离心、弃上清、重悬、孵育，清洗、重悬混匀后上机检测线粒体膜电位及线粒体肿胀；取适量海马，制样，采用HPLC 法检测海马ATP、ADP、AMP 含量[14]，并根据公式计算能荷值：EC =([ATP]+0.5[ADP])/([ATP]+[ADP]+[AMP])。

2.4 大鼠海马PI3K和AKT表达测定

取适量海马，制样、凝胶电泳分离、转膜、封闭、一抗于4℃孵育过夜，用TBST 洗膜，重复洗3 次，于室温孵育二抗90 min，重复洗膜3 次。ECL 化学发光显色，分析各蛋白相对表达量。

2.5 数据处理与统计方法

3 结果

3.1 芎归不忘散对VD模型大鼠学习记忆能力的影响

如图1所示，随着训练时间，各组动物逃避潜伏期均有不同程度缩短，但模型组相较于假手术组缩短时间较少。在检测日，与模型组比较,芎归不忘散高、低剂量组逃避潜伏期显著缩短，其中高剂量组(F =25.85；P = 0.0071)，低剂量组（F = 24.36；P = 0.0078）；高低剂量组穿越平台次数显著增加(P<0.01)。

图1 XGBWS对VD模型大鼠学习记忆能力的影响

图2 XGBWS对VD型大鼠海马CA1区病理形态学影响

3.2 芎归不忘散对VD模型大鼠海马CA1区病理形态学影响

如图2 所示，与模型组相比，经过干预后，芎归不忘散明显改善VD 模型大鼠海马CA1 区神经细胞排列稀疏、神经细胞数量减少和细胞固缩等病理变化（P<0.05）。

3.3 芎归不忘散对VD模型大鼠海马线粒体肿胀度及膜电位的影响

如图3所示，与模型组相比较，芎归不忘散高剂量组显著下调线粒体肿胀度(P < 0.05)，高、低剂量均能显著上调线粒体膜电位(P<0.05)。

3.4 芎归不忘散对VD模型大鼠线粒体功能的影响

由图4 所示，与模型大鼠比较，芎归不忘散高、低剂量能显著提高海马内能荷及ATP 含量（P < 0.05），AMP和ADP的含量无明显变化（P>0.05）。

3.5 芎归不忘散对PI3K/AKT 信号通路相关蛋白的影响

由图5 可知，与模型组比较，芎归不忘散高、低剂量均显著提高VD 模型大鼠p-PI3K 和p-AKT 蛋白表达（P<0.05）。

4 讨论

图3 XGBWS对VD模型大鼠海马线粒体的影响

VD 是由缺血缺氧性脑血管疾病等脑血管异常引起的一种认知功能损伤综合征，临床多表现多为记忆功能衰减或认知功能下降及海马CA1 区神经元病变[14-18]。本次研究发现，VD 模型大鼠逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数显著减少，海马CA1 区神经元数量减少明显、神经细胞坏死明显增多、细胞排列不整齐。经过XGBWS 干预后，VD 模型大鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数显著增多，明显减缓海马CA1区不同程度病理变化，说明XGBWS 可显著改善VD 模型大鼠学习记忆能力和海马CA1区病理情况。

图4 XGBWS对VD模型大鼠海马线粒体功能的影响

图5 XGBWS对VD模型大鼠脑PI3K/AKT信号通路的影响

ATP 作为机体直接能源物质，而ADP、AMP 是ATP不完全水解产物，机体通过不断进行ADP-ATP再循环完成能量的穿梭转换。能荷则是代表总的腺苷酸系统中所负荷的高磷酸基数量，对代谢起着重要调控作用。因此能荷、ATP、ADP、AMP 含量均能反映线粒体功能。线粒体膜电位与线粒体大小均是反映线粒体结构的重要指标。已有研究表明线粒体功能损伤、能量代谢失常是VD 的发病机制[19-21]。本次研究结果表明，VD 模型大鼠海马中ATP 含量及能荷值均降低，且线粒体肿胀变性、膜电位下降。经XGBWS 干预后，模型大鼠脑线粒体肿胀度显著降低，膜电位下降得到改善，能荷、ATP 含量显著增加，ADP、AMP 含量基本不变。提示XGBWS 修复VD 模型大鼠线粒体结构异常进而达到改善线粒体功能的目的，即XGBWS对线粒体具有保护作用。

然而，线粒体功能由多种因素共同调控，其中PI3K/AKT 信号通路在线粒体保护及能量代谢中扮演着重要角色[22-23]。已有研究表明多种VD 动物模型及细胞模型均显示PI3K/AKT 信号通路呈抑制状态[24]，这与本研究结果一致，通过XGBWS 干预后，可以激活PI3K/AKT 信号，上调p-PI3K、p-AKT 的表达。综上，XGBWS 明显改善VD 模型大鼠学习记忆功能障碍，其作用机制可能是通过激活PI3K/AKT 信号通路达到保护或修复受损的线粒体，进而达到改善脑能量的目的。