饲料中多种雷琐酸内酯类药物残留检测方法研究

■蒋 慧 程林丽

(中国农业大学动物医学院，北京100193)

雷琐酸内酯类药物属于同化激素中的非甾类雌性激素，主要包括α-玉米赤霉醇（ZER）、β-玉米赤霉醇(β- ZAL)、玉米赤霉烯酮(ZON）、α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL)和玉米赤霉酮(ZAN）[1]。具有抗菌、抗疟疾等作用[2]，能促进蛋白质合成、增重、提高瘦肉率和饲料转化率[3]，但同时也有致癌、致畸、致突变以及其它潜在的健康安全隐患。目前许多国家已禁止使用该类药物促进家畜的生长，我国的农业农村部公告中对于玉米赤霉醇的使用也有了明确规定[4]，但由于其经济回报高，违法使用的现象仍然存在，除此之外饲料霉变也可能导致该类药物的产生。

我国有关饲料中雷琐酸内酯类药物的检测方法标准主要有3个，其中农业部1486号公告—6-2010规定了饲料中雷琐酸内酯类药物的气相色谱-质谱检测方法，检测限与定量限分别为2 μg/kg 和5 μg/kg[5]。GB/T 19540—2004 规定了玉米赤霉烯酮的薄层色谱测定方法和酶联免疫吸附测定法，最低检测量分别为为20 μg/kg 和0.25 μg/kg[6]。GB/T 28716—2012 规定了饲料中玉米赤霉烯酮含量的免疫亲和柱净化高效液相色谱的测定方法，检测限与定量限分别为2 μg/kg和10 μg/kg[7]。

由于雷琐酸内酯类药物与一些其他真菌毒素及药物等结构相似且在饲料中的含量有可能较低，为了从源头上解决雷琐酸内酯类药物的残留，对饲料品质进行监控，需要采用高准确度和精密度的定性定量方法。而气相色谱-质谱法(GC/MS)方法正是生物样品及饲料中雷琐酸内酯类药物高准确度和精密度检测的经典测定方法之一。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Shimadzu GC-2010 Plus 气相色谱-质谱联用仪(GC/MS），配电子轰击离子源(EI)，日本Shimadzu 公司；MP2002 型电子天平（感量0.01 g），上海舜宇恒平科学仪器有限公司；FA1204C 精密电子分析天平（感量0.000 01 g），上海越平科学仪器有限公司；Sep-Pak SiLica 固相萃取装置，美国Waters 公司；HQ-60-II 涡旋混合器，北方同正生物技术发展有限公司；SHK-99-Ⅱ台式空气恒温摇床，北方同正生物技术发展有限公司；TARGIN®VX-Ⅲ多管涡旋震荡器，北京踏锦科技有限公司；5804R 高速冷冻离心机（可达8 000 r/min，相对离心力为7 012 g），德国Eppen⁃dorf 公司；DGF25012CN 电热恒温干燥箱，上海市跃进医疗器械一厂；N-Evap112 氮吹仪，美国Or⁃ganomationAssociates 公司；MiLLi-Q 超纯水系统，美国MiLLipore 公司。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品

α-玉米赤霉醇；β-玉米赤霉醇；玉米赤霉酮；α-玉米赤霉烯醇；β-玉米赤霉烯醇；玉米赤霉烯酮，纯度均≥99%，均来自美国Sigma公司。

1.2.2 试剂

甲醇、乙腈、甲酸色谱纯，水为符合GB/T 6682 规定的一级水。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

甲醇-水（80+20，v/v）：用量筒分别量取80 ml 甲醇和20 ml水，置于同一玻璃瓶内，摇匀。

乙腈-水（10+90，v/v）：用量筒分别量取10 ml 乙腈和90 ml水，置于同一玻璃瓶内，摇匀。

标准贮备液(100 μg/ml)：用精密电子分析天平分别称取六种雷琐酸内酯类药物各0.01 g（精确到0.000 01 g），并置于100 ml 容量瓶，向其内加入甲醇进行溶解稀释定容。-20 ℃冰箱中保存3个月。

标准贮备液(1 μg/ml)：取100 μg/ml 雷琐酸内酯类药物标准储备液1 ml于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，4 ℃冰箱中保存1个月。

标准工作液：取适量1 μg/ml 六种雷琐酸内酯类药物混合后的标准贮备液，用乙腈稀释成0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg/ml和1 μg/ml的标准工作液。4 ℃冰箱中保存1周。

1.3.2 采样和试样制备

按照相关国家标准，取饲料样品，采用四分法缩减取约200 g，粉碎后过0.45 mm 孔径的分析筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。用于后续的药物提取以及药物添加回收试验。

1.3.3 样品处理

1.3.3.1 提取

称取5 g 饲料于50 ml 离心管中，加15 ml 甲醇-水（80+20，v/v），盖好管盖后可将多个离心管一起置于试管架上以同时在多管涡旋震荡器上涡旋1 min，之后将试管及试管架一起固定在台式空气恒温摇床上震荡40 min。8 000 r/min 离心10 min，将上层的提取液快速倒入另一50 ml离心管中，再取15 ml甲醇-水（80+20，v/v）于下层饲料残渣所在的离心管中，重复震荡，离心等步骤，之后合并两次提取液，定容至30 ml，混匀备用。

1.3.3.2 净化

从上一步骤所得的混合提取液中取3 ml 溶液于10 ml离心管中。加3 ml正己烷，涡动1 min，6 000 r/min离心1 min，之后倒掉上清液。下层用3 ml 正己烷重复洗涤一次。50 ℃水浴中用氮气吹至1 ml 左右，加入2 ml水充分溶解残液，为上样溶液。取固相萃取装置，将6 cc/500 mg HLB固相萃取柱安装于其上，依次用5 ml 乙腈和5 ml 水预洗，取3 ml 上样溶液过柱。之后依次用乙腈-水（10+90，v/v）和水各5 ml 进行淋洗。待溶液全部滴下后抽真空1 min。再用含6%的甲酸乙腈10 ml 洗脱，待溶液全部滴下后抽真空1 min，将洗脱液收集到试管中。50 ℃氮气吹干（当溶液剩下2 ml左右时，取出，涡动10 s，待残留于试管上方管壁的药物重新溶解于溶液中后接着氮吹至干），供衍生化用。同时取500 μl 标准工作液于试管中，50 ℃氮气吹干，供衍生化用，作为对照标准品。

上样溶液和洗脱液的流速均控制在1 ml/min 以内。衍生化之前的氮吹过程中一定要尽可能地吹得足够干，以免影响衍生化效果。

1.3.3.3 衍生化

加衍生化试剂200 μl，涡动溶解，封口膜密封，60 ℃恒温箱中衍生化15 min，冷却至室温后加入300 μl小衬管中供气相色谱-质谱测定。样品溶液中药物浓度超过检测范围时用甲苯稀释后进样。

1.3.4 测定

1.3.4.1 色谱参考条件

气相色谱柱：Rtx-5MS，长度：30 m，膜厚：0.25 μm，内径：0.25 mm。或DB-5MS 柱等相当者。载气：氦气，载气流速：1.0 ml/min。进样口温度：250 ℃。进样量：1 μl，不分流。柱温程序：起始120 ℃，以15 ℃/min的速度升至280 ℃，保持5.2 min。

1.3.4.2 质谱参考条件

电子轰击电离(EI)。电离能量：70 eV。接口温度：280 ℃。离子源温度：230 ℃。溶剂延迟：7 min。采集方式：选择离子检测（SIM）。开始时间：7 min，结束时间：15.9 min。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

文献报道的饲料及生物样品中雷琐酸内酯类药物检测方法的提取剂主要有甲醇、乙酸、乙酸乙酯、甲醇-水（80+20，v/v）、乙腈-水（84+16，v/v）。

试验结果表明，这些提取溶剂均具有很好的提取效果，但甲醇对少数预混合饲料中的药物提取率低，乙腈-水（体积比84:16）对某些配合饲料中的药物提取率低，甲醇-水（体积比80:20）做提取溶剂时的饲料适用范围最广，对供试饲料基质中药物的提取效率均超过了90%，因此最后确定使用它作为提取溶剂。

2.2 提取方法的选择

文献报道的相关提取方法主要为涡旋震荡和/或超声之后过滤或离心的方法。

农业部1486 号公告—6-2010 标准方法简单的采取涡动1 min 和3 600 r/min 离心5 min 的方法，经过两次提取，药物提取率相对较低。再此方法的基础上，本试验采取涡动1 min 后采用台式空气恒温摇床震荡40 min的方法，并提取两次。

2.3 净化方法的选择

农业部1486号公告—6-2010标准方法要经过两次液液分配、多次氮气吹干、外加固相萃取小柱净化过程。整个净化过程繁琐，耗时长，样品前处理过程过于复杂，不利于我国饲料监控过程中的时效要求。在该方法的基础上，我们将HLB 小柱从60 mg 换成500 mg，经过进一步优化过柱条件，大大地提高了小柱的净化效果。因此减除了乙醚-0.1%碳酸钠洗涤和多次浓缩置换溶剂的步骤，大大地简化了净化步骤，将工作量缩减了三分之二，样品前处理时间缩短了一半。

2.4 质谱条件的优化

根据六种药物的分子结构特征，采取选择离子检测模式，参考农业部1486 号公告—6-2010 的仪器分析条件，对六种雷琐酸内酯类药物进行测定。采用Rtx-5MS 毛细管柱代替原来的DB-5MS 分离柱。载气流速为1 ml/min，进样口温度280 ℃，炉温初始120 ℃，以15 ℃/min 的速率升至280 ℃，并在此温度下保持5.2 min，色谱时间15.9 min。由于两种玉米赤霉烯醇在实际样品的检测过程中发现，m/z536定量比m/z305定量的抗干扰能力更佳，因此采用前者为定量离子。在此条件下，六种雷琐酸类酯类药物分离良好。各化合物的定性定量离子见表1。

表1 雷索酸内酯类药物的定性离子和定量离子(m/z)

2.5 标准曲线

在给定仪器条件下，对0.001、0.005、0.01、0.05、0.1 μg/ml 和0.5 μg/ml 标准工作液衍生化后进样分析，以标准溶液的浓度为横坐标，定量离子的色谱峰峰面积值为纵坐标作标准曲线。测得六种雷琐酸内酯类药物的标准曲线图见图1，相关方程和线性相关系数见表2。以上结果表明，在0.001～0.5 μg/ml 范围内，药物浓度与峰面积呈线性相关。在进行实际样品的分析时，如果分析物的终浓度不在这个线性范围，则应该将分析物进行稀释或浓缩。

图1 雷琐酸类酯类药物标准曲线

2.6 方法的灵敏度

在本试验条件下，以外标法定量。检测限以空白样品中与标准品药物保留时间相同位置的基线噪声的3倍值为依据，定量限以空白样品在标准品保留时间的基线噪声的10 倍值为依据，测得配合饲料中六种雷琐酸内酯类化合物的检测限均为2.0 ng/g，定量限均为5.0 ng/g，能够满足饲料中雷琐酸内酯类药物的分析需要。

对配合饲料进行5.0 ng/g 的空白添加回收试验，往空白饲料中添加相应量的标准贮备液，涡动，混匀，使饲料中各化合物的药物浓度为5.0 ng/g。静置15 min 以上，按样品前处理过程进行提取和净化，衍生化，之后采用气相色谱质谱法进行分析，结果见表3。各化合物的回收率水平在71%～91%之间，变异系数在1.69%～9.73%之间。该结果表明，定量限添加水平的准确度和精密度均满足痕量分析方法的要求。

表2 雷索酸类酯类药物标准曲线方程

表3 5.0 ng/g雷索酸类酯类药物的空白添加回收结果（n=3）

2.7 方法的准确度和精密度

为考察方法的精密度、准确度数据以及其适用范围，对配合饲料进行空白添加回收试验。称取5 g 空白饲料，往其内添加相应量的标准贮备液，对六种药物设0.01、0.1、2.0 μg/g 三个添加水平。每个水平设4 个重复。涡动，混匀，静置15 min以上，按样品前处理过程进行提取和净化，经衍生化后采用气相色谱质谱仪进行分析。添加回收结果如表4 所示。在这些不同的饲料和不同的药物添加水平上，各个药物的添加回收率范围均在80%～94%之间，变异系数均小于12%。由此结果可知，对饲料中此六个化合物分析的准确度和精密度均符合饲料中污染物检测和饲料药物添加剂检测的方法要求。

3 讨论

本试验在参考文献的基础上，通过对提取溶剂、提取条件、净化方法、以及仪器检测条件的选择与调整，对饲料中雷琐酸内酯类药物的气相色谱-质谱检测方法进行了优化。采用甲醇-水（80+20，v/v）为提取液，正己烷除脂（正己烷萃取，然后除去正己烷层，可以帮助除去脂类而不影响目标物回收）和6cc/500 mg HLB固相萃取柱净化，经过衍生化试剂BSTFA+TMCS(99+1)衍生化，之后采用气相色谱质谱仪进行分析，外标法定量。该方法的准确性、精密度和灵敏度均达到我国对饲料中雷琐酸内酯类药物检测的要求。与农业部1486 号公告—6-2010 方法比较减少了操作步骤和溶剂的使用，大大节约了检测时间，提高了检测效率。与农业部1486 号公告—6-2010 方法的详细比较见表5。

表4 添加回收率和变异系数（n=4）

表5 本方法与农业部1486号公告—6-2010方法的对照

4 结论

该检测方法，对六种雷琐酸内酯类药物检测限均为2.0 μg/kg，定量限均为5.0 μg/kg，在0.01、0.1、2.0 μg/g 添加水平下，平均回收率为80%～94%之间，变异系数均小于12%，能够满足饲料中雷琐酸内酯类药物的分析需要。且与农业部1486 号公告—6-2010方法比较实验流程更方便快速，更适合大批量日常分析检测。