手足清栓通过抗病毒降低71型肠道病毒(EV71)感染小鼠死亡率

张 真,李 敏,李 丽,申 梦,刘 媛,赵忠鹏,包金风,李秀惠∗ (1.内蒙古医科大学 基础医

学院,内蒙古 呼和浩特010000；2.军事科学院 军事医学研究院 微生物流行病研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071；3.首都医科大学 附属北京市佑安医院,北京100069；4.山西农业大学 动物科技学院,山西 太谷030800)

71型肠道病毒(enterovirus 71,EV71)属于小RNA 病毒科肠道病毒属中的A 类肠道病毒,是引起近年手足口病(hand,foot and mouse disease,HFMD)暴发流行的主要病原体[1],常经消化道感染与传播,引起手、足、口等部位的水疱和皮疹等轻症病例[2]以及脑干脑炎、神经源性肺水肿等重症病例。HFMD 是我国法定报告管理的丙类传染病,近年来,发病人数呈上升趋势,与其他型肠道病毒相比,由EV71 引发的手足口病的死亡率和致残率较高[3]。初步研究表明,过量的病毒增殖和过激的炎症反应可能是造成HFMD 重症化的根本原因[4]。

目前,临床尚缺乏特效药,对于HFMD 的治疗仍以对症治疗为主,主要包括物理方法降温、抗炎、控制并发症等[5]。现在,用于临床治疗EV71感染的药物,主要是抗病毒药物,以利巴韦林、干扰素、特异性免疫球蛋白为代表,但临床治疗指南指出,利巴韦林和干扰素在早期应用可能有一定的疗效,晚期治疗效果不明显,且病人还要承担药物毒性引发的额外风险[6]。

鉴于重症EV71感染会导致患儿神经系统并发症,严重影响患儿的预后,寻找安全、有效的治疗药物就显得格外重要。中药在抗病毒感染方面有独特的优越性,一方面可直接抑制或灭活病毒[7],另一方面可通过调节机体免疫系统发挥降低损伤效应的作用[8]。已有研究表明,清开灵口服液、热毒宁、喜炎平注射液等中药制剂在缓解HFMD 患儿症状中效果显著[9-11]。荆芥、鱼腥草、青蒿等中草药在体外有明显的抗病毒活性[12-13]。

手足清栓是由治疗手足口病的中药方剂开发而成的中药栓剂,其主要成分为藿香,栀子,青蒿,黄芩。其中,藿香具有祛风散寒、祛湿、发汗抗菌的功效。青蒿除具有清热解毒,除蒸、截疟的传统功效之外,最新研究表明,还具有抗菌抗病毒、免疫调节等药理作用[14]。黄芩则具有清热燥湿,泻火解毒的功效。现代药理学研究发现黄芩具有抗菌、抗病毒和抗炎等作用,对急、慢性炎症反应均有抑制作用。另外,黄芩也具有提高机体免疫功能的作用,黄芩苷锌络合物能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数[15]。栀子泻火除烦,清热利尿,凉血解毒,具有抗炎,降温和解热的作用[16]。然而,手足清栓作为治疗手足口病的一线中药制剂,尚缺乏高质量的循证医学证据和基本的实验室试验数据,其量效、时效、毒性等需要进一步明确,其作用机制也有待阐明[13]。

本研究通过已经建立的EV71-BJ 株(EV71 BJ09/07株)感染Vero细胞模型和7日龄昆明小鼠重症HFMD 模型[17],综合考察手足清栓对感染EV71-BJ株小鼠的保护作用及其可能的作用机制,为手足清栓治疗HFMD 提供理论证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级7日龄昆明小鼠,购自斯贝福实验动物有限公司。实验动物的饲养和使用按照军事医学研究院的相关规定进行。

1.2 细胞和培养基Vero细胞(ATCC NO：CCL-81),来自军事医学研究院微生物流行病研究所细胞库；细胞培养基为DMEM 培养基,购自Gibco；胎牛血清购自内蒙古金源康生物科技有限公司。

1.3 药物和试剂手足清栓[18],处方为黄芩6 g、炒栀子3 g、青蒿4 g、广藿香油0.2 m L。批号：20181201,规格：3.716 g 生药/m L,课题组自制。Quantitative analysis IL-6、TNF-alpha、MCP-1 ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；MTS细胞增殖定量检测试剂盒购自Promega 公司；TB GreenPremix Ex TaqⅡ购自Ta KaRa；其余试剂均为分析纯,购自军事医学研究院科研条件处。

1.4 病毒毒力测定利用Vero细胞测定EV71-BJ毒株TCID50,按照文献[19]进行。

1.5 手足清栓对细胞和健康小鼠毒性(CC50、MLD)的测定在Vero细胞上测定手足清栓导致50%细胞病变(50%cell cytotoxitity,CC50)的浓度,即检测生药1.5～48.0 g/L 对Vero细胞的毒性,按照文献[4]进行。手足清栓导致50%小鼠死亡的浓度(median lethal dose,MLD)测定方法如下,加入无菌PBS 配制成肠灌洗液,于7 日龄昆明小鼠,以7.43～37.16 g/kg的量连续直肠给药4 d,观察至第14天判定结果。使用Karber法计算手足清栓CC50和MLD。

1.6 测定手足清栓体外抗EV71活性96孔细胞培养板每孔加入104Vero细胞,37℃、5%CO2培养箱中过夜培养至90%以上单层,弃去原培养液,随机分为7组,即PBS组、感染组和5个浓度梯度的手足清栓药物组(生药0.6～6 000.0 mg/L)。细胞处理及细胞存活率测定方法同1.5。

1.7 手足清栓治疗EV71-BJ株感染小鼠有效剂量的测定将1×107TCID50的EV71-BJ株腹腔注射7日龄昆明小鼠作为EV71感染致重症HFMD 模型,按照文献[4]进行。将重症HFMD 小鼠分为5个浓度梯度的手足清栓药物组(生药0～22.1 g/kg)和PBS健康小鼠对照组,每组10只。测定方法如下：手足清栓加入无菌PBS配制成肠灌洗液,于7日龄昆明小鼠,治疗组感染后2～5 d,每天分别直肠给予0～22.1g/kg的手足清灌洗液治疗,而PBS为健康小鼠对照组(不使用药物,不感染病毒),每天观测小鼠疾病状态和存活情况至感染后14 d,以确定手足清栓治疗重症HFMD 的量效效应。

1.8 病毒组织载量及血清炎症因子的检测病毒组织载量及血清炎症因子检测于感染后6 d分别取不同组织样本,按照文献[17]进行。

1.9 动物组织病理学检查感染后6 d取小鼠肌肉组织样本,在10%福尔马林中固定48 h后,送军事医学研究院微生物流行病研究所进行病理学检测。

1.10 数据分析使用GraphPad Prism 5 进行数据分析和作图。数据以±s表示,以P＜0.05判定为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EV71-BJ毒株的毒力测定结果新建EV71-BJ毒株病毒库在Vero细胞和7日龄昆明小鼠的毒力分别为1.0×108TCID50/m L和20 LD50/m L。

2.2 手足清栓药物毒性(CC50、MLD)测定结果见图1,手足清栓对Vero 细胞的CC50约为12 g/L。当手足清栓质量浓度不高于生药12 g/L时,细胞毒性较弱,Vero细胞存活率约50%；当手足清栓质量浓度低于6 g/L 时,Vero细胞存活率与PBS组相似。Vero细胞存活率随手足清栓质量浓度增加而明显降低。进一步探讨了手足清栓对健康小鼠的毒性作用,结果见图2,手足清栓对健康小鼠的MLD约为40 g/kg。手足清栓经肠灌洗途径施加于7日龄健康昆明小鼠,当手足清栓质量浓度低于11.15 g/kg时,小鼠存活率与PBS组相似。小鼠存活率随手足清栓质量浓度增加而明显降低。

图1 手足清栓对Vero细胞的细胞毒性CC50测定结果

图2 手足清栓经灌肠途径对乳鼠的毒性测定结果

2.3 手足清栓对EV71-BJ株病毒感染细胞模型和小鼠模型的保护作用在EV71感染细胞模型上,手足清栓具有缓解Vero细胞病变,维持Vero细胞活力的作用。如图3 所示,与单独接种1×107TCID50EV71 模型组相比,手足清栓(生药60 mg/L)显著提高细胞模型的存活率(P＜0.01)。此外,其他各质量浓度的手足清栓也对接毒细胞存活率有不同程度的提高。

图3 手足清栓在Vero细胞上对EV71的抑制IC50测定结果 ∗P＜0.05；∗∗P＜0.01。下同

腹腔注射1×107TCID50EV71-BJ株于7日龄昆明小鼠建立的重症HFMD 模型较为稳定,小鼠发病率100%。如图4所示,与模型组相比较,不同质量浓度的手足清栓经肠灌洗途径均能够减少EV71导致的小鼠死亡率,降低小鼠体质量下降率,具有改善小鼠临床体征,延长小鼠存活时间的作用。其中,手足清栓11.05 g/kg治疗组发病症状明显减轻,死亡率下降显著。如图5所示,当小鼠感染EV71后从第5天开始模型组表现为后肢麻痹,精神萎靡,活动减少,并出现竖毛现象,肛门部位也有较多稀便,而手足清栓(11.05 g/kg)治疗组小鼠临床症状明显减轻,并有部分小鼠后肢恢复正常且尿便正常,精神和行动活跃。

图4 乳鼠保护力测定结果 A.体质量变化；B.生存率；C.临床疾病得分(0.健康；1.精神萎靡、活动减少；2.竖毛、弓背、共济失调；3.消瘦或体质量呈负增 长；4.四肢麻 痹；5.濒死或死亡)

图5 手足清栓11.05 g/kg对动物模型的治疗效果示意图

2.4 细胞和组织病毒载量测定结果在EV71感染细胞模型上,手足清栓能缓解Vero细胞病变,维持Vero细胞活力。如图6 所示,手足清栓(生药60 mg/L)显著抑制EV71-BJ毒株的增殖(P＜0.01)。

7日龄昆明小鼠腹腔注射EV71-BJ株后经手足清栓灌肠治疗,于感染后6 d取小鼠的脑、直肠、后肢肌肉组织做病毒载量检测,结果如图7所示,于感染EV71-BJ后在小鼠脑、直肠、后肢肌肉组织中均可检测到病毒,且在模型组中后肢肌肉的病毒载量高于直肠和脑组织,药物组(手足清栓11.05 g/kg)治疗后则能不同程度地减小以上组织中的病毒载量,在肌肉、直肠组织中的效果最为显著(P＜0.000 1)。

图6 手足清栓在细胞上抑制病毒效应检测结果

2.5 手足清栓治疗明显减轻重症HFMD 小鼠组织损伤取感染后6 d小鼠后肢肌肉进行H.E.染色,病理学检测结果表明,与模型组相比较,经手足清栓治疗后,EV71感染小鼠后肢损伤、炎性细胞浸润明显减轻(图8)。

图7 EV71感染后6 d小鼠组织病毒载量检测结果

图8 病理变化结果 A.模型组肌肉；B.治疗后肌肉；C.模型组肠；D.治疗后肠；E.模型组脑；F.治疗后脑

2.6 血清炎症因子检测结果炎症因子检测结果显示,与模型组相比较,经手足清栓治疗的小鼠血清中IL-6、TNF-a、MCP-1含量显著下降,表明手足清栓显著降低了小鼠的炎症反应(图9)。

图9 血清炎症因子检测

3 讨论

EV71感染一般引起轻症HFMD,大多患儿不治自愈,但近年来,亚太地区HFMD 暴发流行,仅2017年中国大陆HFMD 发病1 929 550例[20]。由于HFMD 由轻症到重症转化的标志不明,特别是由轻症到重症转化的时间窗口特别短,HFMD 患儿及家属不免陷入恐慌。HFMD 致病机制至今仍尚未见有报道,严重阻碍了HFMD 靶点型药物研发。病原体的大量增殖和过激的机体炎症反应可能是HFMD 造成机体组织损伤的两大因素,这在小鼠动物模型中也得到了证实[21]。目前,临床上对HFMD 的治疗,偏重于对症治疗和维持治疗。实验室筛选的HFMD 相关治疗药物,大多属于抗病毒药物,仅有极少部分为免疫调节性药物。鉴于至今没有疗效确实的抗EV71的靶点性西药,最近几年国内外关于抗EV71中药的研究日益增多,从中筛选出抗EV71的有效成分已成为一种研究热点。中药以其天然,毒副作用少为优点,并且在抗病毒的同时还可以解热、抗炎,有的甚至可以提高免疫力,因此被众多国内学者青睐[6]。

中医认为手足口病属湿热范围,清热解毒是主要的治疗方法[22]。手足清栓是由治疗手足口病有效的中药方剂经改变用药途径开发而成的中药栓剂,其主要成分为藿香、栀子、青蒿和黄芩。中医认为具有清热解毒,抗炎,提高免疫力的作用。从药理机制上分析认为,青蒿中含青蒿素、青蒿酮、黄酮类等成分,具有提高免疫力、镇痛、抗炎、解热、抗病毒、抗菌等效果[23]。栀子中含有去羟栀子苷、栀子苷等苷类成分,具有抗病毒、抗菌作用[16]。黄芩中的黄芩素、黄芩苷等通过多种环节影响花生四烯酸代谢,从而减轻炎性介质介导的扩张血管、增加血管壁通透性及白细胞的趋化作用[24],其作用机制可能与减少TNF-α、IL-6等炎性因子的水平有关。

临床上,EV71 重症感染时,病毒可侵入中枢神经系统引起炎症和损伤,诱发神经源性肺水肿、循环和呼吸衰竭甚至死亡[25]。在EV71 重症患者的血清和脑脊液中能够检测到包括白介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、巨噬细胞炎症蛋白1α(macrophage inflammatory protein 1α,MIP-1α)、CCL2等在内的大量炎症分子的异常增高[26-27]。众多研究表明,IL-6的表达水平可以作为判断HFMD 患者预后的指标之一[28]。实验室建立的动物模型中,除神经源性肺水肿难以呈现外,其余症状,小鼠和乳猴模型皆有呈现。本课题组建立的EV71-BJ感染细胞和小鼠模型,能够基本呈现HFMD 的临床症状和病理变化,是药物筛选的有力助手,在此模型上,相继评价了喜炎平和热毒宁2个中药注射剂[4,29]。

本研究借助该模型对手足清栓治疗HFMD 的作用效果进行了初步探索,侧重对药物毒性和药物效果浓度范围进行了摸索,对临床合理用药提供了基本参考。当手足清生药质量浓度为11.05 g/kg时,可明显降低小鼠死亡率,提高小鼠体质量增长率,减轻小鼠发病症状,并明显改善肌肉组织病理学变化,降低肌肉组织中MCP-1、TNF-α、IL-6 的浓度,该有效质量浓度低于毒性质量浓度(22.3 g/kg)。

与化学药物相比,中成药是由多成分、多因素构成的复杂体系,具有作用靶点多、无细菌、耐药性等优势,同时随着新兴技术的应用,显著提高了中药制剂的质量控制要求。本试验对手足清栓治疗HFMD 的作用机制进行了初步探索,结果表明手足清栓具有抗EV71病毒活性作用。采用Vero 细胞感染EV71病毒模型,手足清栓(生药60 mg/L)能显著抑制EV71-BJ毒株的增殖,远低于其无毒质量浓度(6 g/L)；同时,生药11.05 g/kg治疗EV71感染小鼠模型时,后肢肌肉、肠、脑病毒载量均大幅下降,这也可能是动物模型治疗后病理改善及炎性因子降低的原因。