鸡胚原代软骨细胞的分离培养及表型鉴定

李赛慧,周佳桦,张雨蓓,张松彬,卞建春,袁 燕,刘宗平,顾建红∗ (1.扬州大学

兽医学院,江苏 扬州225009；2.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州225009；3.江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏 扬州225009)

近年来,随着禽类养殖规模的上升,骨关节炎、骨软症、佝偻病、肉鸡胫骨软骨发育不良以及蛋鸡产蛋疲劳综合征等骨类疾病的发病率也逐年升高[1],然而这些疾病的治愈率却很低。鸡胫骨软骨发育不良是危害肉禽养殖业发展最严重的骨骼疾病之一。该病在世界范围内流行,会导致病禽发育不良,生长缓慢,胫骨易骨折,对肉禽养殖业造成巨大的经济损失[2]。软骨形成是维持动物骨骼正常发育的关键过程[3],但是软骨细胞缺乏再生能力[4-6],软骨组织难以自我修复[7-8],所以临床上常见的禽类骨关节炎、滑囊炎、软骨发育不良和关节软骨磨损等疾病都很难治愈。

软骨细胞来源于骨髓间充质细胞,其形成过程始于间充质细胞的增殖、聚集,然后分化为增殖性软骨细胞,继续发生肥大后分化为无增殖活性的肥大软骨细胞,最后发生矿化进入终末分化阶段形成骨组织[9]。据报道,软骨细胞在分化的不同阶段可表达分泌不同的标志性基因及蛋白,幼稚型软骨细胞可表达Y 染色体性别决定域(sex determination region of Y chromosome,sry),基因家族sox家族的sox5、sox6 及sox9 转录因子,分泌Ⅱ型胶原蛋白(collagen type Ⅱ,colⅡ)、蛋白聚糖(aggrecan,acan)等；肥大前软骨细胞可表达分泌甲状旁腺激素1 受体(parathyroid hormone 1 receptor,pth1r)和印度刺猬因子(Indian hedgehog,ihh)；早期肥大软骨细胞可表达分泌Ⅹ型胶原蛋白(collagen typeⅩ,colⅩ)；晚期肥大软骨细胞可表达分泌血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,vegf A)及基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinases 13,mmp13)[3,10-12]。因此,软骨细胞可负责产生、维持和降解蛋白聚糖、透明质酸、胶原纤维等细胞外基质(extracellular matrix,ECM),其中最主要的两个大分子是Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖。不同部位软骨细胞分泌的基质发挥着不同作用,关节软骨细胞分泌的ECM 主要是赋予关节表面抗拉强度和柔韧性,而生长板软骨细胞分泌的基质则具有矿化作用,这些功能差异体现了软骨细胞的特异表型。

禽类骨骼发育程度对于其生产性能的高低有决定性作用,随着养殖业的快速发展,肉鸡生长迅速,但随之而来的骨骼类疾病也日益增加。家禽骨骼与哺乳动物存在差异,禽类骨骼较哺乳动物骨骼壁薄而轻,强度高,且肉仔鸡易发胫骨软骨发育不良[13]。因此,成功建立鸡胚原代软骨细胞培养体系,将有利于研究软骨细胞在家禽骨骼及钙磷代谢中的作用及机制。本试验采取骨架染色法观察不同日龄鸡胚软骨发育情况,在此基础上用胰酶和Ⅳ型胶原酶分步消化法分离鸡胚原代软骨细胞,采用阿利新蓝染色法鉴定及检测分化阶段标志基因表达,建立了鸡胚原代软骨细胞体外培养方法,为研究软骨细胞在家禽骨骼及钙磷代谢疾病中的作用及机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料SPF鸡胚,购自山东益吉达生物科技有限公司。

1.2 试剂和仪器DMEM 培养基(12800-058,Gibco)；胎牛血清(900-108,Gemini)；Ⅳ型胶原酶(BS035A,Biosharp)；胰蛋白酶(0458-25G,Amresco)；阿利新蓝(66011,Sigma)；茜素红,标准阿利新蓝染色液试剂盒(G8550,G1560,北京索莱宝科技有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8,LQ732,东仁化学科技有限公司)；Trizol(15596018,Ambion)；PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA(R123-01/02/03,Vazyme)；Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Q331-01/02/03,Vazyme)。

二氧化碳恒温培养箱(Thermo,USA)；Milli-Q Biocel型超纯水系统(Millipore,USA)；DMI 3000型倒置显微镜(Leica,Germany)；台式高速冷冻离心机(Eppendorf,Germany)；NanoDrop 2000(Thermo fisher,USA)；ABI-7500实 时 荧 光 定 量PCR 仪(ABI,USA)。

1.3 骨架染色取7～21日龄鸡胚,放置于自来水中1～5 h,65℃热水浸泡鸡胚20～30 s,将鸡胚放入平皿中,用镊子和剪刀尽可能地去除皮肤和内脏组织,放入95%乙醇中固定过夜。将鸡胚移入100%丙酮中,室温过夜。转用0.3 g/L 阿利新蓝染液浸泡鸡胚,室温过夜。95%乙醇冲洗2次后浸入95%乙醇中室温过夜脱色。在10 g/L 的KOH 中浸泡1 h 后,0.05 g/L 茜素红复染3～4 h后继续放置于KOH,4℃浸泡1～3 d(根据日龄和染色情况)。转移到试剂1(KOH∶甘油＝4∶1)中室温过夜；再转移到试剂2(KOH∶甘油＝1∶1)中室温过夜；最后转移到试剂3(KOH∶甘油＝1∶4)中储存并拍照。

1.4 鸡胚原代软骨细胞分离培养75%酒精棉球消毒鸡蛋气室一端,无菌取出鸡胚,断颈处死后置于含PBS 的玻璃皿中；取出股骨、胫骨置于另一含PBS的玻璃皿中；用眼科镊分离出胫骨远近两端的软骨,去除结缔组织,用PBS冲洗3遍；眼科剪剪碎软骨块,使其大小为1～3 mm。2.5 g/L 胰酶消化30 min,弃去胰酶,PBS冲洗3遍；2 g/L Ⅳ型胶原酶消化6 h,每间隔1 h用20 m L移液管充分吹打几次。消化至无肉眼可见的软骨组织,用移液器吹打,收集至离心管,1 300 r/min离心15 min；弃去上清,用无血清DMEM 和含10% FBS 的DMEM 培养基,分 别 清 洗1 次。加 入4 m L 含10%FBS 的DMEM 培养基,反复轻柔吹打,将收集的细胞悬液400目筛网过滤,然后进行细胞计数。以2.5×105～5.0×105个/m L 的密度接种于6孔板或96孔板,置于37℃,体积分数为5% CO2恒温培养箱内,每隔48 h换液1次。

1.5 CCK-8检测鸡胚原代软骨细胞增殖率取培养1,3,5,7 d的鸡胚原代软骨细胞检测原代软骨细胞增殖率。按照CCK-8试剂盒说明书检测细胞增殖率：弃去培养基,每孔加入10μL CCK-8溶液,置于培养箱中孵育1～4 h,酶标仪测定450 nm 处的吸光度。

1.6 鸡胚原代软骨细胞阿利新蓝染色取细胞培养板弃去培养基,用预热至37℃的PBS冲洗2次,按照阿利新蓝染色试剂盒说明书进行染色,倒置显微镜观察摄片。

1.7 RT-PCR 检测鸡胚原代软骨细胞标志性基因

用Trizol法提取培养1,3,5,7 d软骨细胞的总RNA,用PrimeScriptTMRT 试剂盒反转录成cDNA,使用SYBR Green Mastermix在ABI-7500实时荧光定量PCR 系统上进行RT-PCR 反应,引物序列见表1。同时以GAPDH 作为内参,用2－ΔΔCt法对RT-PCR 结果进行数据分析。

表1 目的基因引物序列

1.8 数据分析所有数据以±s表示,用Graph-Pad Prism 6软件进行统计学分析,组间比较采取t检验。P＜0.05和P＜0.01分别表示差异显著和差异极显著。

2 结果

2.1 鸡胚骨架染色阿利新蓝和茜素红染色7～21日龄鸡胚骨架,骨架中软骨组织呈蓝色,矿化组织呈紫红色(图1 A～G)。7 d鸡胚骨架主要为软骨组织,尚未见明显的矿化组织(图1 A)；8,9 d鸡胚开始出现矿化组织(图1 B、C,箭头所示为矿化组织)；12 d鸡胚骨架软骨和矿化骨之间可明显区分开(图1 D)；15 d鸡胚骨架软骨和矿化骨之间的分界更加清晰,关节软骨发育逐渐完善(图1 E)；18,21 d鸡胚骨架多见矿化组织(图1 F、G),但软骨占比减少。

图1 不同日龄(d)鸡胚骨架阿利新蓝/茜素红染色

2.2 体外培养鸡胚原代软骨细胞增殖情况CCK-8法检测原代软骨细胞培养1,3,5,7 d增殖情况,结果可见,前3 d增殖较慢,3～5 d时增殖较快,5 d时到达增殖高峰期,5～7 d增殖又减慢(图2)。

图2 体外培养鸡胚原代软骨细胞的增殖率 ∗P＜0.05；∗∗P＜0.01。下同

2.3 体外培养鸡胚原代软骨细胞形态刚消化下来的鸡胚软骨细胞呈圆球形,悬浮状,较为圆润。在5%CO2恒温培养箱中培养2 h左右部分细胞开始贴壁,1 d后细胞呈现圆形、梭形、三角形和多角形等不同形态(图3A),2 d后细胞增殖开始变快、胞浆丰富饱满(图3B),5 d时细胞之间联系紧密,局部细胞连成一片,呈现典型的“铺路石状”(图3C),越往后培养这种“铺路石状”越多,细胞个体肥大(图3D、E)。

2.4 体外培养鸡胚软骨细胞蛋白聚糖强阳性分离的鸡胚软骨细胞经阿利新蓝染色,软骨细胞多呈圆形或多边形,胞浆呈现蓝色(图4A),而成纤维细胞(阴性对照)阿利新蓝染色,细胞多呈长条形或梭形,胞浆无蓝色颗粒(图4B)。

2.5 体外培养鸡胚原代软骨细胞标志基因表达

实时荧光定量PCR 检测结果(图5)显示,分离培养的原代软骨细胞的早期表达基因sox9、colⅡ、acan的m RNA 表达随体外培养时间延长逐渐下降,且与1 d相比,5,7 d差异极显著(P＜0.01),晚期表达基因vegf A和mmp13 的m RNA 表达逐渐升高,且与1 d相比,5,7 d差异显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)。

图3 体外培养鸡胚原代软骨细胞形态(200×) A.1 d；B.2 d；C.5 d；D.8 d；E.9 d

3 讨论

本试验先通过骨架染色观察鸡胚关节软骨发育情况,选择软骨发育良好,软骨量多,且与矿化骨分界明显的15日龄鸡胚,用于软骨取材。因为不同的酶浓度和消化时间对细胞有不同程度的损伤,所以需要先通过预试验确定合适的酶浓度和消化时间,以最大程度上减少酶对细胞的损伤。本试验最终采用2.5 g/L胰蛋白酶消化30 min和2 g/L Ⅳ型胶原酶消化6 h两步消化法获取细胞。

图4 体外培养鸡胚软骨细胞和成纤维细胞阿利新蓝染色 A.体外培养鸡胚软骨细胞(200×)；体外培养鸡胚成纤维细胞(200×)

图5 体外培养鸡胚原代软骨细胞标志基因表达

体外培养鸡胚原代软骨细胞1 d后开始缓慢增殖,3 d后增殖速度加快,5 d时增殖开始减慢,细胞呈现出典型的“铺路石状”。为了鉴定软骨细胞表型,采用阿利新蓝染色法,阿利新蓝是显示酸性黏液物质的特异性染料,可用于软骨细胞的鉴定以及软骨组织的酸性黏蛋白、蛋白多糖等的定量分析。本试验体外分离培养的鸡胚原代软骨细胞阿利新蓝染色强阳性,而作为对照的鸡胚成纤维细胞染色阴性,初步证明分离培养的细胞为软骨细胞。

据叶菲等报道[13-14],原代软骨细胞在向终末期成熟分化的过程中,colⅡ和acan的表达逐渐减弱；而促成熟分化因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,alp)和mmp13的表达则逐渐增强。本试验中RT-PCR 结果显示,分离培养的鸡胚原代软骨细胞的sox9、colⅡ、acanm RNA 表达随培养时间延长逐渐下降,vegf A和mmp13 m RNA 表达则逐渐升高,这与上述报道一致,表明此次获取的鸡胚原代软骨细胞能向终末期成熟分化。

虽然现在国内外对软骨细胞的研究越来越深入,但仍然有很多难题亟待解决,比如：如何快速地获取大量软骨细胞,如何维持软骨细胞正常表型,如何使得软骨细胞定向增殖分化,如何在软骨细胞传代过程中避免去分化现象,如何将软骨细胞培养方法运用到软骨组织工程上,而这些问题的解决都将会为临床上软骨疾病的诊治和软骨组织损伤的修复提供理论基础和有力的帮助。

综上所述,本试验通过骨架染色观察鸡胚软骨发育状态确定了适宜的取材时间,并利用胰蛋白酶和Ⅳ型胶原酶两步消化法分离细胞,所获得的细胞在体外能增殖,且逐渐分化成熟,因此成功建立了鸡胚原代软骨细胞的体外分离与培养方法。