甘草酸二铵抗流感病毒的作用机制

付新亮,范 迪,刘乙兴,方 博,刘文俊,田允波,黄运茂∗ (.仲恺农业工程学院 动物科技学院

广东省水禽健康养殖重点实验室,广东 广州510225；2.华南农业大学 兽医学院,广东 广州510642)

A 型流感病毒(influenza A virus,IAV)是引起人类呼吸道疾病的重要病原,历史上流感病毒的几次大暴发造成大量人员死亡[1]。特别是近些年H7N9、H10N8、H5N6 等新型流感病毒的出现,对流感病毒的防控提出了新的挑战[2-4]。流感病毒的防制主要依靠疫苗和药物两种手段,虽然疫苗免疫是防控流感病毒有效的方法,但由于流感病毒变异速率非常快,需要经常更新疫苗毒株和开发新的疫苗。目前,用于防治流感病毒的药物主要有2类药物,一种是M2蛋白粒子通道抑制剂(金刚烷胺等),另一种是NA 蛋白神经氨酸酶抑制剂(奥司他韦、扎那米韦等)。随着这两类抗流感病毒药物的广泛使用,导致大量耐药毒株的出现和耐药性的产生,因此需要开发新的抗流感病毒药物来解决耐药性的问题。

目前,许多天然小分子化合物的抗病毒活性得到越来越多的重视和研究。其中甘草酸(glycyrrhizin,GL)作为甘草主要的生物活性成分,已经被证实具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎和抗病毒活性[5]。CINATL等[6-7]报道GL 可以抑制SARS冠状病毒吸附宿主细胞和内吞的过程,从而阻断SARS冠状病毒的复制,发挥抗病毒作用。HUAN 等[8]报道GL可以抑制PEDV 进入宿主细胞和抑制PEDV 的复制,还可以降低促炎细胞因子m RNA 的表达水平。关于GL抗病毒的具体作用机制还不是很明确,目前已经报道了GL 可以影响一些信号通路,比如蛋白激酶C、酪氨酸激酶和NF-κB 信号通路等,从而发挥其抗病毒功能。本研究探讨甘草酸二铵(diammonium glycyrrhizin,DG)的抗流感病毒作用及其机制,证实DG 可抑制流感病毒的复制,为抗流感病毒药物的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 DG 细胞毒性测定按照CCK-8细胞活性检测试剂盒的操作说明,测定50,250,500,1 000,1 500,2 000 mg/L DG 对MDCK 细胞的细胞毒性,并设阴性对照组和空白对照组,每个质量浓度6个重复。计算不同质量浓度DG 条件下的相对细胞活性,以确定DG 的最大安全浓度。细胞相对活性的计算公式如下：细胞存活率＝[(D试验孔－D空白孔)/(D对照孔－D空白孔)]×100%。

1.2 证明DG 具有抗流感病毒作用本研究中选取pdm09 H1N1作为代表毒株,研究DG 对流感病毒的抗病毒作用及其作用机制。100 TCID50的pdm09 H1N1感染MDCK 细胞,同时各加入终质量浓度为50,250,500 mg/L 的DG,并设置阴性对照组,置于37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h。弃掉病毒液,用PBS 洗2 次后加入含以上不同质量浓度DG 的维持液,继续培养48 h后,测定病毒滴度,并通过间接免疫荧光验证不同质量浓度DG 作用后病毒的复制和NP蛋白表达情况。

1.3 DG 抗流感病毒作用机制研究为研究DG 抗流感病毒的作用机制,分别从流感病毒复制周期的的吸附、进入和复制阶段开展研究,以验证DG 在流感病毒复制周期的哪个阶段发挥抗病毒作用及其具体作用机制。

1.3.1 DG 的直接杀病毒作用 分别用终质量浓度为50,250,500 mg/L 的DG 与100 TCID50病毒液37℃孵育1 h后感染MDCK 细胞,并设置对照感染组,48 h后测定各组病毒滴度,探讨DG 是否对流感病毒有直接杀灭作用。

1.3.2 病毒吸附抑制试验 分别用终质量浓度为50,250,500 mg/L的DG 与100 TCID50病毒液一起接种MDCK 细胞,置于4℃条件下孵育1 h(4℃条件下病毒只能吸附在细胞表面,不能进入细胞)。弃去病毒液,用PBS洗两次后加入维持液,继续培养48 h后测定病毒滴度。

1.3.3 病毒进入抑制试验 100 TCID50的病毒液接种MDCK 细胞,4℃条件下孵育1 h(病毒吸附到细胞表面),弃去病毒液后用PBS洗2次,分别加入终质量浓度为50,250,500 mg/L DG 的DMEM,37℃孵育1 h(病毒进入细胞阶段)后弃去DG,加入维持液继续培养48 h后测定病毒滴度。

1.3.4 病毒复制阶段抑制试验 100 TCID50的病毒液接种MDCK 细胞,37℃孵育1 h(病毒已经进入细胞),弃去病毒液后用PBS洗2次。分别加入终质量浓度为50,250,500 mg/L DG 的维持液,继续培养48 h 后测定病毒滴度。

1.3.5 细胞因子表达水平测定 100 TCID50病毒液接种MDCK 细胞,37℃孵育1 h后,PBS洗2遍,并加入终质量浓度为500 mg/L DG 的维持液,继续培养48 h后,收获细胞,提取RNA。用2-ΔΔCt相对定量 的 方 法 测 定 各 组 细 胞 中IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8共6种细胞因子m RNA 的表达情况,qPCR 引物见表1。

表1 细胞因子Real-time qPCR 引物

1.4 数据统计分析数据的统计分析及图表绘制均通过Prism Graphpad 6.0软件完成,通过t检验的方法对组间数据进行差异性分析。

2 结果

2.1 DG 的细胞毒性测定不同质量浓度的DG 孵育MDCK 细胞48 h后,细胞存活率如图1所示：随着DG 质量浓度的增加,细胞的存活率也逐渐降低,当DG 质量浓度增加至500 mg/L 时,细胞的存活率还可以维持在87%左右,并且DG 的50%细胞毒性质量浓度(CC50)接近2 000 mg/L,说明DG 对细胞的毒性较低。根据DG 细胞毒性测定结果,选取500 mg/L作为后续DG 抗病毒分析的最大质量浓度。

图1 不同质量浓度DG 对MDCK 细胞的细胞毒性作用

2.2 DG 抗流感病毒作用研究在流感病毒感染MDCK 细胞过程中及感染细胞后,用不同质量浓度的DG 进行处理,并用抗病毒药物利巴韦林作为对照。结果显示,随着DG 质量浓度的增加,其抗流感病毒作用越来越明显(图2,3)。当DG 质量浓度为250 mg/L 时,病毒滴度开始出现明显下降,DG 质量浓度增加至500 mg/L 时,病毒滴度下降非常显著。IFA 结果显示,DG 可以抑制流感病毒NP蛋白的表达,并且随着DG 浓度的增加其抑制作用越明显(图3)。以上结果表明DG 可以抑制流感病毒的复制,并且其抗病毒作用具有剂量依赖性。

图2 不同质量浓度的DG 对流感病毒复制的抑制作用 ∗∗P＜0.01；∗∗∗P＜0.001。下同

图3 不同质量浓度的DG 对流感病毒蛋白表达的影响(100×)

2.3 DG 对流感病毒复制周期的影响为探讨DG对流感病毒复制周期的影响,分别研究了DG 对病毒的直接杀灭作用、对病毒吸附的影响、对病毒进入细胞的影响以及对病毒复制的影响。结果显示,用不同质量浓度的DG 与病毒孵育1 h后再感染MDCK 细胞,发现DG 处理组和对照组的病毒滴度并没有明显变化(图4A),说明DG 对流感病毒没有直接杀灭作用。DG 对流感病毒吸附和进入细胞影响的结果显示,DG 对流感病毒吸附和进入细胞的过程均没有影响(图4B,C)。DG 对流感病毒进入细胞后复制过程的影响结果显示,与对照组相比,质量浓度为250,500 mg/L DG 处理组的病毒滴度显著降低(图4D),说明DG 在流感病毒的复制过程发挥抗病毒作用。以上结果表明,DG 对流感病毒早期复制阶段(吸附和进入)没有抑制作用,而是抑制流感病毒进入宿主细胞后的复制过程。

图4 DG 对流感病毒复制周期的影响 A.直接杀病毒作用；B.吸附细胞过程；C.进入细胞过程；D.复制过程

2.4 DG 抗流感病毒作用机制研究为进一步研究DG 抗流感病毒的作用机制,通过相对定量PCR 法比较DG 处理组和未处理组在流感病毒感染后48 h IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8细胞因子m RNA 的表达水平。结果显示,与空白对照组相比,这6种细胞因子的m RNA 表达水平在2个感染组中均显著升高(图5)。值得注意的是,病毒感染对照组和DG 处理组中IFN-γ和TNF-α的m RNA表达水平也存在明显的差异,其中DG 处理组中IFN-γmRNA 的表达水平要显著高于感染对照组,其表达水平升高约1.7倍(P＜0.01)；而DG 处理组中TNF-α的m RNA 表达水平显著低于感染对照组,其表达水平降低约2.4 倍(P＜0.001)(图5)。由此,可以初步推测DG 通过其免疫调节功能发挥抗病毒作用。

图5 DG 处理组和对照组中不同细胞因子m RNA 的表达水平

3 讨论

目前流感病毒的耐药性已经非常普遍,许多相关的耐药位点也不断被发现,如 NA 蛋白Glu119Gly、Arg152Glu和Arg292Lys,以及M2 蛋白Ser31Asn等,这些氨基酸位点的突变均与流感病毒的耐药性有关[9-12],因此,需要不断研究开发新的抗流感病毒药物。甘草酸是中药甘草中主要的生物活性成分,许多研究已经报道甘草酸具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒等生物活性。DUAN 等[13]报道甘草酸可以抑制猪蓝耳病毒(PRRSV)的复制以及病毒蛋白的表达,并且随着剂量的增加,抑制效果越明显,进一步研究发现甘草酸主要通过抑制PRRSV 进入宿主细胞的过程来发挥抗病毒作用,而对病毒吸附宿主细胞和病毒粒子释放过程没有显著的影响。HUAN 等[8]报道甘草酸可以抑制PED对宿主细胞的感染,进一步研究发现甘草酸可以抑制PED 进入宿主细胞以及病毒复制的过程,另外,还证实甘草酸可以降低PED 感染宿主细胞后促炎细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)m RNA 的表达水平,从而减轻宿主的炎症反应。除此之外,甘草酸还可以抑制SARS冠状病毒、伪狂犬病病毒、肝炎病毒、HIV 和疱疹病毒等[7,14-16]。本研究中,我们以pdm09 H1N1作为代表毒株,研究DG 对流感病毒的抗病毒作用,并深入分析DG 抗流感病毒作用的机制。结果表明,DG 具有抗流感病毒的作用,250 mg/L的DG 即可明显抑制流感病毒的复制和NP蛋白表达,并且其抑制作用具有剂量依赖性。

目前的抗病毒研究策略主要是通过抑制病毒复制过程中关键蛋白的功能,从而阻断病毒的复制周期,例如抑制病毒的聚合酶活性、吸附、膜融合和病毒粒子释放等过程[10]。我们进一步研究了DG 对流感病毒复制周期的影响,结果表明DG 对流感病毒没有直接杀灭作用,对流感病毒吸附和进入宿主细胞的过程也没有影响,而是抑制流感病毒进入细胞后的复制过程,说明DG 通过抑制流感病毒复制的后期阶段而发挥抗病毒作用。

WANG 等[17]报道甘草酸可以影响一些细胞内的信号通路,例如蛋白激酶Ⅱ、酪氨酸激酶Ⅱ以及NF-κB信号通路等,而甘草酸的免疫调节功能可能是由于这些信号通路的激活或关闭来实现的。为了进一步研究DG 抗流感病毒作用的分子机制,我们通过qPCR 比较了流感病毒感染MDCK 细胞后DG处理组和未处理组细胞因子m RNA 的表达水平。结果表明,DG 处理组和未处理组之间IFN-γ 和TNF-α的mRNA 表达水平也存在有明显的差异,其中DG 处理组中IFN-γ m RNA 的表达水平要显著高于未处理组,而DG 处理组中TNF-α的mRNA表达水平显著低于未处理组。干扰素是机体先天性免疫应答系统中的重要组成部分,在抵抗病毒感染过程中发挥着重要作用[18]。流感病毒感染宿主细胞后,宿主细胞通过Toll-like受体识别流感病毒的组分,通过一系列信号通路的激活使干扰素刺激基因(ISGs)的表达上调,最终诱导干扰素的产生,发挥抗病毒作用并激活其他免疫细胞[19]。TNF-α、IL-6和IL-8是机体重要的炎症因子,当这些炎症因子正常表达时,可引起机体轻微的炎症反应有利于抵抗病毒的感染,而当这些炎症因子过量表达时会引起机体剧烈的炎症反应,造成机体严重的病理性损伤[20-21]。我们的研究结果表明,用DG 处理流感病毒感染的MDCK 细胞,一方面可以诱导宿主细胞产生IFN-γ,通过其免疫调节功能来抵抗流感病毒的感染；另一方面,DG 还可以降低炎症因子TNF-α的表达水平以减轻TNF-α诱导的炎症反应,降低宿主的免疫损伤。