纳米花结合G-四链体对大肠杆菌的可视化检测方法的建立

贾 静,沈明浩,万家余 (1.吉林农业大学 食品科学与工程学院,吉林 长春130200；2.军事医学研究院军事兽医研究所,吉林 长春130122)

食品安全问题逐渐成为全球关注的公共卫生问题,食品微生物污染则是全球最重要的卫生问题之一,也是导致食源性疾病的首要原因[1]。其中致病性大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌[2]等是主要病原菌,每年约有10亿的检测量。大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是一种重要的临床致病菌,能够引起引起水样腹泻,出血性结肠炎[3],肺炎及菌血症等疾病,主要在免疫力底下的人群中发生,尤其是在幼儿和老年人[4]。且在自然界中广泛存在,在空气、水、灰尘、人和动物的排泄物中都可找到,所以E.coli极易污染食物,无论是在发达国家还是发展中国家,由E.coli引起的食物中毒在细菌性食物中毒中均占较大比例[5-6]。人们对致病性E.coli的了解大多来自E.coliO157∶H7的暴发感染研究,该病原体于1982年首次被确定[7]。根据美国疾病控制和预防中心(CDC)的报告,在2003—2008年E.coliO157∶H7感染在美国引发了32次暴发[8],其中包括与受污染的菠菜、卷心菜和生菜有关的大规模暴发[9-10]。所以我们选取E.coliO157∶H7作为此次试验的目的菌。

E.coliO157∶H7的常规检测方法为标本培养和菌落计数,其具有足够的敏感性和选择性,但是该方法劳动密集,耗时(需要5～7 d)且需要专业操作。在过去的几十年中,已经开发了许多类型的E.coliO157∶H7快速检测方法,包括基于核酸的聚合酶链反应(PCR)技术[11-12],酶联免疫吸附试验(ELISA)[13]和免疫磁分离法[14]。然而,基于PCR的测定和微阵列技术[15]由于样品基质中组分的抑制而具有高错误结果的风险,而且检测过程中会产生交叉凝集等现象[11]；ELISA 操作简单,成本较低,灵敏度较高,但一些试剂盒特异性较低,会因样品成分干扰出现假阳性,并且ELISA 需要额外的标记抗体[13]；而免疫磁性分离方法通常需要其他方法的组合[14,16]。由于专业仪器和操作有限,这些测试结果不容易被肉眼观察到,所以急需一种快速、准确、特异敏感且肉眼可见的检测手段来检测食品中的致病性E.coli。纳米花作为一种新的化合物还未被应用到病原菌的检测中,本试验采用纳米花结合点击化学及G-四链体对食源性病原菌建立了快速便捷的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂包含链霉亲和素蛋白的磁珠(MB,直径0.8 mm,10 g/L)购自Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd(挪威)；修饰生物素的E.coli抗体购自生工试剂有限公司(中国长春)；硫酸铜购自上海阿拉丁试剂有限公司(中国上海市)；硫酸二铵(AP),尿素,氯化钾等金属离子购自广州化学试剂厂(中国广州)；SYBR GreenⅡ,血红素(hemin),二甲基亚砜(DMSO),3,3′,5,5′-四甲基联苯胺盐酸盐二水合物(TMB·2 HCl)购自Cellway-Lab(中国洛阳)；磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠购自Genetimes Technology,Inc.(中国上海)；过氧化氢(H2O2)购自广州伟晶科技有限公司(中国广州)。所有化学品均来自Sigma-Aldrich,Inc.(Saint Louis,MO,USA),且均为分析试剂级质量,无需进一步纯化即可使用。本研究中使用的所有缓冲溶液均在本试验室进行制备。

1.2 仪器与设备Multiskan MK3 Thermo Scientific酶标仪(中国上海)；Tanon 1600自动数字凝胶图像分析系统(中国上海)；电热恒温培养箱(美国SHELLAB公司)；Thermo Fisher离心机(中国上海)。

1.3 方法试验原理见图1。

1.3.1 菌种的培养 用接种环从菌株保存液中蘸取少量菌液在LB 固体培养基平板上划板,37℃烘箱中培养24 h后观察菌落形态。从平板上挑取完整的单菌落于LB 液体培养基中,37℃摇床中培养16 h,放入4℃冰箱中保藏备用。

1.3.2 纳米花的制备 采用的纳米花是铜离子、刀豆蛋白、PBS三合一纳米花。在10 mmol/L的PBS缓冲液中加入50 mmol/L 硫酸铜溶液和0.05 g/L刀豆蛋白溶液,室温(RT)下放置16～24 h。在12 000 r/min转速下离心,弃去上清,再用0.1 mmol/L的PBS缓冲液进行清洗3次,100μL PBS重悬浮备用。纳米花具有材料简单、易制备和价格便宜等优点,常温条件下就可以合成,而且易储存,不需要放在冰箱中保存。

1.3.3 磁珠的处理 购买的修饰SA 的磁珠存放在在保藏液中,表面有大量的防腐物质,使用之前需要对其进行清洗。吸取5μL 带有保藏液的磁珠置于EP管中,用磁石吸住,用10μL缓冲液清洗3次,后续为了更有效地去除未结合的反应物,避免未结合的物质干扰,需使用10～30μL的PBS缓冲液进行清洗。

1.3.4 G-四链体的形成 将包含Cu2＋的纳米花加入到含有G1/G2(各5μmol/L)的混合物中,在室温(RT)下孵育60 min后,通过15%TBE/尿素变性PAGE分离反应混合物。于160 V 电压下在1×Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液(90 mmol/L Tris,90 mmol/L 硼酸和10 mmol/L EDTA,p H8.0)中进行1 h电泳。

1.3.5 TMB 显色 G-四链体形成后,在其中加入浓度为25μmol/L的血红素5μL,混合物继续摇动20 min,以在水溶液中形成血红素/G-四链体HRP-模 拟DNA 酶。在 催 化 反 应 中,将10 μL 的500μmol/L 的H2O2和10μL TMB 原 液 加 入 到DNA-血红素混合物中,将溶液转移到96孔微量滴定板中,使用微板读数器记录每个孔中D450nm值。

图1 试验原理图

2 结果

2.1 抗坏血酸浓度的优化试验需要抗坏血酸来释放纳米花中的Cu2＋,而且在Cu＋引发环加成反应中,抗坏血酸作为还原剂,用于将Cu2＋还原成Cu＋。在显色反应步骤中,除了TMB 的氧化之外,H2O2还可以与抗坏血酸反应,从而影响试验结果,所以要选取最优的抗坏血酸浓度,在保持其他条件不变时,G-四链体片段浓度为5μmol/L,点击化学反应时间为60 min,血红素浓度为25μmol/L,分别选取0,1,2,3,4,5μmol/L 抗坏血酸,如图2所示,由试验结果可知抗坏血酸浓度在2μmol/L 时显示效果最好,过高或过低都会影响显色效果。

图2 抗坏血酸浓度的优化

2.2 形成G-四链体的2个富G 短片段浓度优化

溶液的颜色强度取决于G-四链体形成序列的产率,也取决于G1/G2片段的浓度。稀释G1/G2片段浓度分别为0,1,3,5,8,10μmol/L。在保持其他条件不变时,抗坏血酸浓度为2μmol/L,点击化学反应时间为60 min,血红素浓度为25μmol/L,从图3可以看出G1/G2片段在5μmol/L 时效果最好,片段浓度过高反而会影响血红素和G1/G2反应形成稳定的G-四链体结构,从而影响试验结果。

图3 G-四链体片段浓度的优化

2.3 点击化学反应时间的优化溶液的颜色强度直接取决于G-四链体形成序列的产率,其反过来也对应于Cu＋引发环加成的点击时间。在保持其他条件不变时,抗坏血酸浓度为2μmol/L,G-四链体片段浓度为5μmol/L,血红素浓度为25μmol/L,选取点击时间分别为0,10,30,60,90,120 min,由图4中可以发现溶液的吸光值随着点击时间的增加而升高,到60 min时进一步增加反应时间并没有导致吸光值的显著增加；因此,从综合试验的快捷性考虑,选取点击化学反应时间为60 min。

图4 点击化学反应时间的优化

2.4 血红素浓度的优化要优化的另一个重要参数是血红素浓度。在点击化学反应之后,将G1/G2混合物与血红素一起孵育以帮助折叠稳定的G-四链体结构。结合一分子血红素的G-四链体结构被认为是稳定的血红素/G-四链体结构。在保持其他条件不变时,抗坏血酸浓度为2μmol/L,G-四链体片段浓度为5 μmol/L,点击化学反应时间为60 min,图5描述了D值对不同浓度的血红素从0到100μmol/L的响应。加入25μmol/L 血红素后溶液的D值显著增加,而当血红素浓度的进一步增加时D值无明显变化；因此,选择25μmol/L 作为血红素的最佳浓度以维持血红素/G-四链体结构的稳定性。

图5 血红素的优化

2.5 灵敏性试验从以上试验中筛选出最佳条件,对检测方法的灵敏性进行分析。选取生长好的E.coliO157∶H7按倍数稀释其浓度,细菌浓度分别为108,107,106,105,104,103,102,10,0 CFU/m L,将其与反应系统反应显色,最终获得数据进行分析。结果如图6所示随着E.coli浓度的升高,吸光值在逐渐加强,且细菌浓度在102CFU/m L 时仍有轻微颜色变化,灵敏度可达到102CFU/m L,所以本检测方法灵敏性良好。该方法在检测范围内呈较好的线性关系,y＝0.041 3＋0.050 1,(R2＝0.996 1),其中y表示吸光值,表示细菌浓度,R2为相关系数。

图6 灵敏性试验

2.6 特异性试验分别选取E.coliO157∶H7、沙门菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、布鲁菌和志贺菌,用所建立的试验方法进行特异性试验,由图7可以看出,所建立的试验方法只对E.coliO157∶H7的效果最好,其余细菌的D值均很低,说明该体系具有较高的特异性。

图7 特异性试验

3 讨论

蛋白质-无机杂化纳米花在生物测定中已经起着至关重要的作用,具有生物识别和信号放大的固有功能[17]；因此,现已开发了蛋白质纳米花的绿色制作方法[18]。纳米花的形成过程：在早期阶段,形成磷酸铜的初级晶体。蛋白质分子与Cu2＋形成复合物,主要通过蛋白质骨架中酰胺基团的配位形成。这些配合物提供了初晶成核的位置。在第二生长步骤中,形成蛋白质分子和初级晶体的大聚集体。磷酸铜晶体的动力学控制生长起源于附聚物表面上的各个Cu2＋结合位点,导致出现单独的花瓣。在最后阶段,各向异性生长导致完整形成分支的花状结构[19-21]。

本试验以修饰链霉亲和素蛋白(SA)的磁珠作为载体,修饰在磁珠上的链霉亲和素和修饰在E.coli抗体上的生物素(biotin)具有较强的结合能力,用结合好E.coli抗体的磁珠特异性抓取E.coli,再用事先制备好的纳米花结合E.coli,因为纳米花中包含的刀豆蛋白(Con A)具有非特异性抓取细菌的功能[18]。将G-四链体富集序列(5′-GTGGGTAGG GCGGGTTGGG-3′)分为2个短G 富片段,用叠氮化合物修饰短片段的3′末端,用炔基修饰另一个片段的5′端[22],在Eppendorf 管中将叠氮-DNA 和炔基-DNA 混合后一起加入已经结合好纳米花的EP管中,利用纳米花中包含的Cu2＋催化叠氮(N3)和炔基(C2H2),通过在2个反应基团之间的环加成反应形成三唑环,将2个短的富G 序列连接成G-四链体结构[23]。在血红素(hemin)的存在下,使hemin/G-四链体结构具有DNA 酶的特性,从而可以催化3,3′,5,5′-四唑甲基联苯胺硫酸盐(TMB)变色。因此,可以通过肉眼观察溶液的颜色变化过程。试验过程中可以用磁铁吸住磁珠,用磷酸盐缓冲液(PBS)将没有结合的部分洗掉,保留所需要的部分。

本试验使用的是点击化学的典型例子,是叠氮基和炔基之间的反应,导致形成[3＋2]环加成产物,五元三唑环[24]。用于生物缀合的点击反应的优点是叠氮化物修饰的分子可以通过三唑键与含炔烃的分子特异性反应,并且2个反应基团通常与在生物系统中遇到的其他官能团是惰性的[25]。

综上所述,本试验很好地结合了纳米花和点击化学G-四链体技术的优点,建立了一种新型、灵敏、快速的可视化食源性病原菌检测方法。传统的病原菌检测方法,操作繁琐,且成本较高,耗时耗力,而且大都由于专业仪器或试验条件的原因,不可清晰地肉眼观察。与传统方法相比较,该方法具有以下优点：操作简便,在室温条件下就可完成,无需大型仪器,耗时较短且肉眼可见,而且只需改变抗体的种类,就可以检测不同的致病菌种类,具有更好的通用性。本试验采用E.coliO157∶H7为目的菌,所以选取的是E.coliO157∶H7的单克隆抗体,如需检测其他种类食源性致病菌,可选用其他细菌的靶向抗体。可视化的检测方法在临床应用上有很好的发展前景。