60Co-γ辐射对黄瓜种子萌发及幼苗生长的影响

陈玉霞， 鉏晓艳， 邱建辉， 谷 峰， 林 勇， 刘尚洪

(湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064)

黄瓜(CucumissativusL.)为葫芦科1年生草本植物，是汉朝张骞出使西域时带回来的，最初为野生，瓜色墨黑带刺，味道非常苦，不能食用，后来经过长期的栽培、改良，才成为现在甜脆可口的黄瓜。黄瓜中含有蛋白质、脂肪、糖类、多种矿物质、微量元素和维生素，其中维生素E含量较高。黄瓜具有清热解毒、调理肠胃、清肺利尿的功效，是人们最常食用的瓜类蔬菜[1]。人们生活水平的提高，对蔬菜的无公害化、周年供应等提出了更高要求，只有培育抗多种病害的黄瓜品种，才能使黄瓜生产无公害和高产稳产成为现实。要在现有基础上育成有突破性的抗病新品种，必须通过创新材料，如发病较严重的枯萎病，现有抗源很少，通过辐射诱变，将可获得高抗枯萎病的突变体，从而获得创新材料。据国际原子能机构(International Atomic Energy Agency，IAEA)2000年统计，全世界利用辐射育种技术育成作物新品种2 252个，其中我国育成农作物品种605个，占世界总和的26.9%，平均推广种植面积达9×106hm2以上，育成的新品种为我国增加粮食 30亿～40亿kg，棉花1.5亿～1.8亿kg，油料 0.75亿kg，创经济效益33亿元[2]。但目前辐射技术在黄瓜上的应用仅有少量报道，李加旺等利用60Co-γ射线辐射处理具有优良特性的黄瓜自交系干种子，并在其变异后代群体中筛选出2个综合性状优良的单株，经3代系选，从中选出主要性状能稳定遗传的株系M-8，并以其为亲本育成适于日光温室栽培的耐低温弱光杂交一代新组合93-5黄瓜[3]。王玉怀利用60Co-γ射线辐射长春密刺干种子，从中发现黄色子叶突变的幼苗，研究表明黄色子叶为核遗传的隐形性状，受核内一对等位基因控制，该性状可作为苗期标记鉴别F1杂种[4]。本研究以60Co-γ射线辐照黄瓜品种新津春4号干种子，考察不同辐照剂量对黄瓜种子萌发、种子细胞膜透性、幼苗子叶叶绿素含量、幼苗生长量、幼苗各部位鲜质量和干质量的影响，并探明黄瓜辐射诱变的半致死剂量，旨在为黄瓜抗病新品种的选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试品种 新津春4号干种子，牛皮纸袋包装，每袋100粒，共8袋。

1.1.2 辐照设备 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所辐照中心60Co-γ射线源，设计装源容量1.85×1016Bq，现有放射源活度1.26×1016Bq，单板3层排列。采用动态步进式辐照方式辐照黄瓜干种子。

1.1.3 仪器试剂 UV-vis8500紫外可见分光光度计、Sartorius电子分析天平、精密电导率仪、培养皿、滤纸、小刀、直尺、刻度试管、移液管、称量瓶、丙酮。

1.2 方法

1.2.1 试验时间和地点 2017年6月在湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所辐照黄瓜种子并进行种子发芽试验和幼苗观察检测分析。

1.2.2 处理设计 共设8个处理：处理1辐照剂量为0 Gy(未辐照种子作为对照)、处理2辐照剂量为50 Gy、处理3辐照剂量为100 Gy、处理4辐照剂量为255 Gy、处理5辐照剂量为500 Gy、处理6辐照剂量为675 Gy、处理7辐照剂量为 880 Gy、处理8辐照剂量为1 000 Gy。

1.2.3 发芽率及生长量测定 样品辐照完毕后，每个处理各取种子30粒，分别放入8个100 mL烧杯中，加水浸种4 h。将滤纸置于培养皿中作发芽床，将种子置于滤纸上，保持滤纸湿润，30 ℃恒温暗培养[5]。种子萌发后，以胚根长达到或超过种子长度为标准记录发芽数。每天统计发芽数，第3天统计发芽势，第5天测量幼苗根长和株高以及幼苗各部位鲜质量、干质量，第7天统计发芽率。

发芽势=第3天发芽种子数/试验种子总数×100%；

发芽率=第7天发芽总粒数/试验种子总数×100%；

发芽指数=在第7天内每天种子发芽数/相对应的种子发芽天数的发芽总和；

活力指数=发芽指数×幼苗鲜质量；

出苗率=子叶完全展开的幼苗数/供试种子数×100%。

1.2.3 细胞膜透性测定 取不同辐照处理的净种子各20粒，用蒸馏水冲洗3次，再用四蒸水冲洗2次。将清洗过的种子放入洁净的100 mL三角瓶中，加入四蒸水60 mL，于25 ℃下浸泡24 h，用精密电导率仪测定浸出液的电导率(C1)，再将种子及浸出液100 ℃水浴30 min，冷却至25 ℃后测定总电导率(C2)[6-7]。

相对电导率=(C1-C0)/(C2-C0)×100%。

式中：C0为四蒸水的电导率。

1.2.4 用叶丝浸提法[8]测定子叶叶绿素含量 用小刀和直尺切取1 cm2子叶叶片，切成长约5 mm、宽约1 mm的细丝，投入5 mL 80%丙酮的刻度试管中，封管口于暗中提取至细丝完全变白为止。分别在663、645 nm处读取提取液的吸光度D，所用公式为：

叶绿素a(Chl a)含量=12.7D663 nm-2.69D645 nm；

叶绿素b(Chl b)含量=22.9D645 nm-4.86D663 nm；

叶绿素总含量(CV)=Chl a含量+Chl b含量；

CA=0.5CV/S。

式中：CA为单位面积的叶绿素含量；S为用于提取叶绿素的叶面积。

1.2.5 半致死剂量(LD50)计算 不同剂量辐照处理后的出苗率是确定辐射损伤效应的重要指标，是计算半致死剂量的依据，半致死剂量是辐射育种适宜诱变剂量的参考[9]。处理种子的出苗率为对照出苗率50%的辐射剂量即为半致死剂量。

2 结果与分析

2.1 辐照处理对黄瓜种子萌发的影响

不同的辐照剂量对黄瓜种子萌发的影响不同，具体结果如图1所示。当辐照剂量为50 Gy(处理2)时，其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数这4项发芽指标均高于对照和其他各辐照处理，分别比对照增加7.47%、4.96%、13.84%、27.04%，特别是发芽指数和活力指数这2项指标明显大幅提高，种子发芽时间短，发芽速度快，发芽整齐度高。当辐照剂量为100～880 Gy时，随着辐照剂量的增加，黄瓜种子发芽进程明显延迟，其发芽势、发芽率，发芽指数、活力指数明显下降，而且剂量越高，下降越明显；当辐照剂量为1 000 Gy(处理8)时，其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数只有对照的58.33%、48.86%、43.51%、12.81%，辐射损伤效应明显。

2.2 辐照处理对黄瓜种子细胞膜透性的影响

辐照处理不仅能引起细胞核中DNA产生变异，同时还会引起膜损伤，膜透性会明显改变，表现出种子浸出液电导率改变，对辐照处理后黄瓜种子 24 h 浸出液电导率及相对电导率测定结果见图2。当辐照剂量为50 Gy(处理2)，2种电导率均低于未辐照处理，说明细胞膜透性小于对照，细胞膜未受到辐射损伤；当辐照剂量为255～880 Gy时，细胞渗出液浓度随着辐照剂量的加大而增加，电导率越大，膜透性越大，细胞受损伤程度越大；当辐照剂量为1 000 Gy时，24 h电导率、相对电导率分别为23.92 μS/cm、29.78%，分别是对照的1.927、2.009倍。黄瓜种子的24 h电导率和相对电导率变化趋势一致。

2.3 辐照处理对黄瓜幼苗子叶叶绿素含量的影响

对苗龄为5 d的黄瓜幼苗，于08：00取样，测其子叶叶绿素含量，结果见图3。从图3可知，当辐照剂量为50 Gy(处理2)时，其子叶叶绿素含量为0.232 mg/dm2，高于对照和其他各处理。处理3以后，随着辐照剂量的增加，子叶叶绿素含量直线下降，到1 000 Gy(处理8)时，叶绿素含量仅为 0.153 mg/dm2，比对照减少29.49%，幼苗叶绿素合成受到严重影响，植株叶面散生条状黄斑。

2.4 辐照处理对黄瓜幼苗生长的影响

对第5天的幼苗，每处理取6株，考察幼苗的生长情况，测定根长和株高，其结果如图4所示。由图4可知，不同的辐照剂量对黄瓜幼苗根系生长影响不同。当辐照剂量为50 Gy(处理2)时，幼苗平均根长为 3.4 cm，较对照增加0.3 cm，侧根发生多，根系生长快。当辐照剂量为100～880 Gy时，随着辐照剂量的增加，受辐照种子的幼苗根系生长明显受到抑制，且剂量越大，抑制效果越明显，侧根发生也受到抑制。当辐照剂量为1 000 Gy时，绝大多数幼苗只有1条主根，平均根长只有0.8 cm，侧根很少发生。

由图4还可知辐照处理对黄瓜幼苗株高的影响与根系相似，当辐照剂量为50 Gy时，幼苗株高为 4.6 cm，高于对照0.4 cm，也高于其他各辐照处理。当辐照剂量为 880 Gy(处理7)、1 000 Gy(处理8)时，株高明显较其他处理低，只有1.1、0.6 cm，分别比对照低3.1、3.6 cm，子叶生长缓慢，且其上散生条状黄斑。

2.5 辐照处理对黄瓜幼苗各部位鲜质量、干质量和干质量/鲜质量值的影响

考察第5天的黄瓜幼苗植株各部位的鲜质量、干质量以及干质量/鲜质量值，结果如表1所示。子叶的鲜质量以处理2最高，平均每株为0.099 3 g，比对照增加0.014 7 g，处理3以后随着辐照剂量的增加，子叶的鲜质量逐渐下降，至处理8时每株子叶鲜质量只有0.030 2 g，仅为对照的35.70%。下胚轴、根系的鲜质量随着辐照剂量的变化情况与子叶相似。

表1 辐照处理对黄瓜幼苗各部位鲜质量、干质量及干/鲜比值的影响

注：测定的各部位数值指平均每株黄瓜幼苗鲜质量和干质量。

子叶、下胚轴、根系3个部位的干质量表现一致，也是处理2最高，处理3以后随着辐照剂量的增加，3个部位的干质量明显下降，剂量越大，下降越明显。

值得注意的是子叶、下胚轴、根系3个部位的干质量/鲜质量值，当辐照剂量为50 Gy时，3个部位的干质量/鲜质量值分别为 0.141 0、0.136 4、0.109 4，均高于对照，3个部位的鲜质量、干质量也高于对照，可见黄瓜种子经50 Gy辐照处理以后，幼苗各部位在增加鲜质量的同时，还使干质量有相应的增加，说明不单是细胞含水量增加。当辐照剂量为100～1 000 Gy时，随着辐照剂量的增加，子叶、下胚轴、根系的干质量/鲜质量值明显上升，有的处理还远远超过对照，这是由于不同剂量的辐照处理使幼苗根系生长受到抑制，根系吸收能力较弱，子叶、下胚轴的生长受到抑制，有机物合成受到影响，各部位鲜质量、干质量低于对照。因此，这种较高的干质量/鲜质量值并不代表植株生长加强，而只是生长受抑制的表现。

2.6 黄瓜干种子辐射处理的半致死剂量

植物种子辐射当代的出苗率是确定辐射损伤效应的重要指标，是计算半致死剂量的依据。黄瓜种子的出苗率是指子叶完全展开的幼苗数占供试种子数的百分比。半致死剂量是辐射育种的适宜剂量。以辐照剂量0、100、255、500、675、880、1 000 Gy 为自变量(x)，相对应的出苗率36.80%、30.63%、26.32%、22.13%、19.27%、17.67%、16.22%为因变量(y，%)，进行回归计算，得a=36.21，b=-0.018 7，直线方程式为y=33.27-0.018 7x。将对照出苗率的50%代入方程式，得LD50=795 Gy。

3 讨论

在一定的剂量范围内，辐射能促进植物种子萌发和幼苗生长。王天龙等研究发现，辐射剂量为 20～60 Gy 时有利于萝卜种子发芽，辐射剂量为 60～150 Gy 时有利于其幼苗根的生长[10]。陈桂松等用低剂量γ射线辐照黄瓜风干种子，发现 4.28 Gy 辐照剂量处理可明显刺激黄瓜增产[11]。本研究发现，当辐照剂量为50 Gy时，黄瓜种子的发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数4项发芽指标均高于对照，促进了黄瓜种子的萌发；第5天的黄瓜幼苗单位面积叶绿素含量高于对照和其他各辐照处理，有利于黄瓜幼苗有机物的合成；50 Gy辐照处理能促进幼苗根系生长，根长最长，侧根发生多，有利于幼苗对水分和养分的吸收；50 Gy辐照处理能增加幼苗子叶、下胚轴、根系3个部位的鲜质量和干质量及干质量/鲜质量值，从而提高幼苗素质。

辐射处理后种子的发芽情况是衡量辐射损伤的重要指标之一。敖妍等发现，对扶芳藤种子辐射后，其发芽率受到的抑制与辐射剂量呈极显著负相关[12]。葛维亚等研究表明60Co-γ辐射处理明显不利于地被菊种子的萌发[13]。在本试验中，当辐射剂量≥100 Gy时，辐射处理对黄瓜种子的萌发具有明显的抑制作用，随着辐照剂量的增加，种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数明显下降，辐照抑制了种子的萌发，其原因可能是辐射对种胚结构及萌发过程的生理活动产生了不同程度的影响。

辐射处理对幼苗生长的抑制作用，也是衡量辐射生物学效应的一个重要指标。从本研究对黄瓜种子辐射处理结果来看，100～1 000 Gy的辐射处理对幼苗生长抑制明显，随辐照剂量的增加，第5天的黄瓜幼苗子叶叶绿素含量逐渐下降，幼苗株高逐渐变矮，根长逐渐变短，子叶、根系及下胚轴生长明显受到抑制，辐照剂量为1 000 Gy时，幼苗生长缓慢，株高最矮，大部分幼苗只有1条主根，侧根很少发生，部分种子虽然能正常发芽，但不能出苗或出苗后逐渐死亡。本试验中还发现，当辐照剂量高于100 Gy时，幼苗的鲜质量、干质量与辐照剂量呈负相关，其原因可能是辐射处理抑制了幼苗根系生长，根系吸收能力较弱，下胚轴和子叶生长受到抑制，有机物合成受到影响。但干质量/鲜质量值与辐照剂量呈正相关，但这并不代表幼苗生长的加强，而只是生长受到抑制的表现。

辐射诱变首先要确定适宜的辐射剂量，才可能获得有益的突变，一般都以半致死剂量作为辐射育种的适宜辐射剂量。耿兴敏等在研究60Co-γ射线辐射对桂花种子萌发及幼苗生长影响时，以辐射处理后桂花品种的发芽率计算半致死剂量，且还发现高剂量辐射后种子虽能萌发，但出苗率受到明显的抑制[14]。熊秋芳等研究发现，低剂量的辐射不会影响萝卜种子的最终发芽率，却抑制了出苗率，且随着辐射剂量的增大，其抑制作用变明显，主要表现为抑制了根茎生长[15]。本研究发现，≥100 Gy辐射剂量处理的黄瓜种子的发芽率与出苗率存在较大差异，部分种子虽然能发芽，但最终未能出苗，以发芽率计算的半致死剂量高于以出苗率计算的半致死剂量，较高的辐射剂量会增加畸变率，从而降低有益突变体的产生。

4 结论

本试验结果表明，60Co-γ射线对黄瓜种子的辐射效应明显。当辐照剂量为50 Gy时，辐射能明显促进黄瓜种子萌发，促进幼苗生长和提高幼苗素质。当辐照剂量为100～1 000 Gy 时，种子发芽率等4项发芽指标、幼苗子叶叶绿素含量、幼苗生长量、幼苗各部位的鲜质量和干质量随辐照剂量的增加而明显下降，而种子细胞膜透性和幼苗各部位干质量/鲜质量值随着辐照剂量的增加而加大，说明辐射能明显抑制黄瓜种子萌发和幼苗生长。经计算，黄瓜种子辐射诱变的半致死剂量为795 Gy。