苹果Actin基因片段克隆及序列分析

秦子禹， 张向昆， 王 娜， 项殿芳

(河北科技师范学院园艺科技学院，河北昌黎 066600)

在植物基因表达研究中，通常需要引入内参基因来矫正系统误差。常用的内参基因有肌动蛋白基因(Actin)、微管蛋白基因(Tubulin)、泛素基因(Ubiquitin)、18SrRNA、组蛋白基因(Histone)等。肌动蛋白(Actin)是普遍存在于真核生物中的一种蛋白质，也是细胞骨架的重要组成成分，它主要参与细胞的变形运动、胞吞与胞吐、细胞分裂、花粉管生长、细胞内物质运输、细胞形状变化、细胞内信号转导以及基因表达与调控等过程[1-3]。此外，Actin基因在核苷酸和氨基酸水平上具有高度的保守性和同源性，据此可将其用于研究不同物种之间的亲缘关系和分化时间[4-5]。目前，已经成功克隆了鸭梨[6]、葡萄[7]、枣[8]、火龙果[9]、香蕉[10]等果树的Actin基因。

苹果是世界四大水果之一，也是我国栽培面积和产量最大的果树[11]。近年来，探究苹果矮化、抗逆性、果实品质形成等方面的分子机制成为研究热点，而寻找到稳定的内参基因是开展相关研究的必备条件之一。鉴于Actin基因的保守性，且已被作为内参基因成功应用在不同作物的分子生物学研究中[12-14]，本研究以我国栽培面积最大的红富士苹果的叶片为材料，采用反转录PCR(reverse transcriptase PCR，RT-PCR)方法，对苹果Actin基因片段进行克隆和生物信息学分析，旨在为深入研究Actin基因的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料、试剂和仪器

红富士苹果叶片采自河北科技师范学院园艺科技学院试验站(119.17°E，39.70°N)。

RNAiso Plus、RNAiso-mate、Recombinant DNase Ⅰ 试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒及pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；2×ESTaqMasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

Bio-Rad S1000 PCR仪、凝胶成像系统Universal Hood Ⅱ为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计与合成 通过比对GenBank中已发表的高等植物肌动蛋白基因(Actin)的核苷酸序列，找到保守区域，采用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物，将上游引物标记为Act-sta-F：TGGTGAAGGCTGGATTTGCT；下游引物标记为Act-sta-R：GACTCGTCATACTCACCCTTGG，预期扩增产物长度为1 048 bp，由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 总RNA提取及cDNA合成 称取0.1 g苹果叶片，利用RNAiso Plus、RNAiso-mate试剂盒，按照试剂盒说明书提取总RNA。再利用Recombinant DNaseI试剂盒对得到的总RNA进行纯化，然后以Oligo(dT)18为引物采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行反转录合成cDNA。

1.2.3Actin基因的PCR扩增 以Act-sta-F、Act-sta-R 为引物，以苹果叶片cDNA为模版进行Actin基因的PCR扩增。扩增体系为cDNA模板 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，2×ESTaqMasterMix 12.5 μL，RNase-free Water 9.5 μL，共计25 μL。反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；72 ℃ 再延伸5 min。

1.2.4Actin基因的克隆与鉴定 PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中观察到符合预期大小(1 000 bp左右)的目标片段，利用DNA凝胶回收试剂盒对其进行切胶回收并纯化后连接到pEASY-T3载体上，转化至EscherichiacoliDH5α感受态细胞中，于37 ℃下在含有氨苄青霉素、X-gal、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体培养基上培养8～14后，挑取阳性单克隆菌落进行增菌培养，用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，并进行PCR扩增和酶切鉴定，同时送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.3 生物信息学分析

将测序结果在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行BLAST同源性分析及保守域查找，然后利用DNAMAN8、MEGA5软件对克隆序列进行氨基酸保守性分析，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 Actin基因的克隆

以从苹果叶片中提取的总RNA为模板，进行反转录合成cDNA后，利用引物Act-sta-F、Act-sta-R进行PCR扩增，获得1条长度为1 000 bp左右的基因片段(图1)，与预期大小相符。将其回收纯化后，连接到pEASY-T3载体上，转化至E.coliDH5α感受态细胞中，按照“1.2.4”节中的方法培养后，挑取阳性单克隆菌落进行增菌培养，用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒后，进行PCR扩增和酶切鉴定，均得到长度为1 000 bp左右的特异片段(图2、图3)，表明该基因片段已被成功克隆，可以进行测序。

2.2 Actin基因的测序结果及序列分析

测序结果(图4)表明，本研究克隆的基因片段长度为1 048 bp。通过BLAST软件搜索比对发现，该序列与其他植物的Actin基因具有高度同源性，其中与白梨(Pyrusxbretschneideri)的同源性高达99%(图5)，与核果类果树桃(Prunuspersica)、中国李(Prunussalicina)和欧洲甜樱桃(Prunusavium)的同源性均为94%，与枣(Ziziphusjujube)的同源性为90%，表明克隆得到的基因片段为Actin基因的一部分，将其命名为MdActin1。

通过DNAMAN8软件将该片段翻译成氨基酸序列，并利用NCBI网站上的BLAST程序对其进行比对分析。结果(图4)显示，该序列编码348个氨基酸，包括338个保守氨基酸，而非保守氨基酸仅为10个，与其他植物肌动蛋白的氨基酸同源性达97%以上，表明该序列在氨基酸水平上高度保守。对MdActin1蛋白进行功能保守域分析， 结果(图5)显示，其同时含有NBDsugarkinase、HSP70、actin superfamily特异性标签，说明MdActin1蛋白为Actin蛋白超家族成员之一。

选取经BLAST分析得出的同源性高的氨基酸序列，利用MEGA5构建系统进化树，结果(图6)显示，MdActin1蛋白与白梨Actin蛋白(登录号：NP_001289215.1)亲缘关系最近，其次为榴莲Actin蛋白(XP_022774869.1)，与番茄Actin蛋白(登录号：NP_001295376.1)亲缘关系最远。

3 讨论与结论

高等植物肌动蛋白是由单一多肽链构成的球状蛋白，包含有375～377个氨基酸，广泛分布于植物的各种组织器官中，且所有植物的肌动蛋白均起源于一个共同祖先[15]。植物Actin基因在进化上极为保守，其碱基替换率非常低，为每1亿年替换1%，因此常将其用于分析物种进化和鉴别物种间的亲缘关系[16]。此外，也常被作为内参基因用于基因表达研究[12-14]。

本研究中克隆的红富士苹果叶片Actin基因序列与白梨Actin基因的同源性高达99%，与核果类果树桃、中国李和欧洲甜樱桃Actin基因的同源性均为94%，与枣Actin基因的同源性为90%，充分证明苹果Actin基因与其他植物Actin基因具有较高的同源性。此外，在其编码的氨基酸序列中，保守氨基酸数量为338个，而非保守氨基酸仅为10个，与其他植物肌动蛋白同源性达97%以上，表明该序列在氨基酸水平上也是高度保守的。该研究结果不仅可丰富高等植物Actin基因的核酸数据库，还可为进一步深入研究植物Actin基因的功能并将其作为内参基因应用于苹果基因表达研究中提供依据。