ATP代谢及嘌呤信号受体在糖尿病创面愈合炎症反应阶段的变化

王 齐，朱冠娅，谢 挺，葛 奎，牛轶雯

1. 上海交通大学医学院附属第九人民医院急诊科，上海 200011；2. 广东省惠州市中心人民医院烧伤外科，惠州 516001；3. 上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤整形科，上海市烧伤研究所，上海 200025

在糖尿病状态下，糖代谢紊乱可导致组织局部的微环境发生一定的变化。研究[1]显示，糖尿病创面愈合过程中，慢性迁延的炎症反应和组织修复迟滞是其主要的病理特征。炎症反应阶段，创面中的炎症细胞（如中性粒细胞、巨噬细胞）的浸润数量及促炎功能均存在一定的不足[2]。腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）是生理状态下维持细胞代谢功能的主要能量物质，在应激状态下也可被作为损伤信号分子释放到胞外以调控多种细胞效应[3]。ATP通过激活嘌呤受体介导嘌呤信号，在炎症细胞的趋化、吞噬和分泌等过程中发挥重要的调控作用，从而参与创面的炎症反应[4-5]；由此推测，ATP代谢在创面愈合过程中与炎症反应密切相关。然而在糖尿病创面的炎症反应阶段，ATP代谢及嘌呤信号是否发生了改变？如若改变，其与糖尿病创面的迁延难愈是否存在一定联系？基于此，本研究通过观察在糖尿病创面愈合的炎症反应阶段，创面组织中ATP代谢、嘌呤信号的改变以及外源性应用ATP后对糖尿病创面愈合情况的影响，探索糖尿病创面炎症反应的转归机制及可能的干预策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠96只[购自上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物科学部，动物生产许可证：SCXK（京）2016-0011]，体质量为20～25 g。该实验小鼠饲养于上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物科学部动物饲养室内的标准笼中，使用许可证：SYXK（沪）2011-0113。于25℃、湿度50%～60%、12 h明暗交替条件下，小鼠自由进食、饮水。动物饲养条件符合实验动物管理条例，所有动物相关操作均遵循国家及上海交通大学医学院附属瑞金医院实验动物科学部有关动物伦理规定及条例。

链腺佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司），3M透明敷料（美国3M公司），免疫组织化学试剂盒、DAB显色液（福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 分组及糖尿病小鼠模型建立 96只雄性C57BL/6J小鼠被随机分为4组，包括糖尿病空白对照组（DC组）、糖尿病ATP干预组（DA组）、正常空白对照组（NC组）和正常ATP干预组（NA组），每组24只；其中DC组和DA组小鼠按照文献[6]建立糖尿病小鼠模型，具体操作如下：禁食24 h后，每日向该组小鼠腹腔

注射1次STZ（50 mg/kg），连续5 d；采集小鼠在建模前、STZ注射3 d后及建模后连续8周（1次/周）的尾静脉血，测定其随机血糖并称量体质量；若建模前小鼠的血糖水平＜8.9 mmol/L，建模后每次监测的血糖水平均≥16.7 mmol/L，体质量明显下降且出现多饮、多尿、体毛发黄，则视为糖尿病模型诱导成功。此外，于上述时间点对正常小鼠（NC组和NA组）行血糖水平监测。

1.2.2 全层皮肤缺损创面模型制作 糖尿病模型建立成功后，参照文献[7]制作全层皮肤缺损创面模型。所有小鼠经腹腔注射0.5%戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行麻醉，而后剔尽其背部体毛，用脱毛膏去除残存鼠毛；脱毛24 h后，再次向小鼠腹腔注射0.5%戊巴比妥钠（60 mg/kg）进行麻醉，而后使用9 mm直径灭菌环钻于其背部正中制造1个全层皮肤缺损创面。分别向DC组和NC组小鼠的背部创面上滴加双蒸水（20 μL）作空白对照，向NA组和DA组滴加100 mmol/L ATP溶液20 μL行ATP干预。静置数分钟，待滴加溶液吸收后于创面加盖3M透明敷料。分别于伤后第1、3、7、14日随机挑选每组小鼠6只，切取创缘皮肤标本后，用颈椎脱臼法处死小鼠。随后，用10%缓冲福尔马林溶液固定部分创缘皮肤组织标本，并于1周内制成蜡块用于后期组织细胞学检测；部分新鲜标本则分装于1.5 mL离心管并于-80℃超低温冰箱保存，用于检测ATP、腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）和腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）含量以及髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的水平。

1.2.3 中性粒细胞浸润观察 取各组创缘伤后第1、3日的石蜡块样本，切片、脱蜡后行苏木精 - 伊红染色（hematoxylin and eosin staining，H-E staining，H-E 染色），于光学显微镜下观察第1、3日的创面炎症细胞浸润情况，每张切片随机选取创缘周围 5个视野，计数中性粒细胞（分叶核）数量。

1.2.4 MPO水平检测 按照酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒说明书步骤，检测各组创缘伤后第1、3日的创面愈合中MPO的含量。

1.2.5 ATP、ADP和AMP含量检测 分别称取创缘伤后第1日NC组及DC组标本各1 g，加入15倍体积的甲醇 - 水溶剂（体积比4:1）和瓷珠，于快速研磨仪用 30 Hz的频率研磨 3 min，在 4 ℃、14 000×g离心15 min，收取上清液。再向残渣中加入15倍体积的甲醇 -水溶剂（体积比4:1），按上述方法重复提取1次，合并2次提取的上清液。取400 μL上清液经氮气挥干后，加入100 μL 50%乙腈水溶液复溶，而后于4 ℃、14 000×g离心15 min，取上清液进行超高效液相色谱 - 串联质谱法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析。

采用HyperCarb PGC色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司）用于分离待测物质。流动相中A为10 mmol/L乙酸铵的水溶液（pH=9，氨水调节），B为10 mmol/L乙酸铵的90%乙腈水溶液（pH=9，氨水调节）。采用梯度洗脱，起始流动相为3%B，12 min后升至100%B并维持14 min，而后返回至3%B维持18 min平衡色谱柱，流速为0.3 mL/min。采用sMRM模式对实验样本和定量标准曲线样本同时检测分析，通过AB Sciex公司Analyst软件控制仪器、采集数据并进一步对ATP、ADP和AMP含量进行定量分析。

1.2.6 Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及 P2Y2表达的观察 将伤后第1、3日创缘组织石蜡样本切片、脱蜡后，用免疫组织化学染色分别标记Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2，并按照免疫组织化学试剂盒说明书进行检测。随意选取各组创缘组织石蜡切片标本6张，每张切片于高倍镜下随机选取5个视野，粗略评估Connexin43、Pannexin1、CD39、P2X7及P2Y2阳性表达的细胞量。

1.2.7 创面愈合评价 于全层皮肤缺损创面模型制作当日及伤后第1、3、7、14日，用无菌透明塑料薄膜临摹各组小鼠背部创面周径后进行图像扫描，通过Image J软件计算创面的面积，并用创面愈合百分比评估创面愈合情况。计算公式为：创面愈合百分比= （初始创面面积－观察日创面面积）/初始创面面积×100%。

1.2.8 组织形态学观察 取各组伤后第7日创缘组织的H-E染色切片标本，于光学显微镜下观察愈合皮肤组织中肉芽生长情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.0软件对研究数据进行统计分析。定量资料用表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 中性粒细胞浸润及计数

创面组织经H-E染色后于光学显微镜下观察发现，炎症反应阶段的糖尿病创面的胶原纤维较纤细，排列紊乱稀疏，创缘组织炎症细胞的集中分布较少；经统计显示，伤后第1日，糖尿病创面（DC组）中的中性粒细胞数量少于正常创面（NC组）（P=0.000），伤后第3日则多于NC组（P=0.002）（图 1）。

图1 DC组和NC组小鼠伤后第1、3日的创面中性粒细胞分布及计数（×200，H-E染色）Fig 1 Distribution and counting of neutrophils in the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded (×200, H-E staining)

2.2 创面组织MPO水平检测

与NC组相比，伤后第1日，DC组创面中MPO的含量较低（P=0.000），伤后第3日则DC组创面中MPO的含量较高（P=0.000）（图2）。

图2 ELISA检测DC组和NC组小鼠伤后第1、3日创面的MPO含量Fig 2 MPO level in the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded by ELISA

2.3 创面组织中ATP、ADP和AMP含量检测

通过UPLC-MS/MS检测DC组及NC组小鼠第1日创面中ATP、ADP和AMP的含量，结果显示DC组小鼠创面中的ATP含量明显低于NC组（P=0.010），而ADP、AMP含量在2组间差异无统计学意义（表1）。

表1 UPLC-MS/MS检测DC组和NC组小鼠伤后第1日创缘组织中ATP、ADP及AMP含量Tab 1 Level of ATP、ADP and AMP in the DC and NC groups on the fi rst day after being wounded by UPLC-MS/MS

2.4 创面组织中Connexin43、Pannexin1阳性表达的观察

研究[8]显示，Connexin43、Pannexin1均表达于细胞膜。本研究通过免疫组织化学染色法标记上述2种蛋白，观察其在创缘组织细胞中的阳性表达情况。结果显示，创面中Connexin43和Pannexin1的表达高峰出现在伤后第1日和第3日，随后其表达量逐渐下降；且在伤后第1日和第3日，DC组小鼠创缘组织中Pannexin1及Connexin43的表达量均低于NC组（图 3）。

图3 免疫组织化学法观察DC组和NC组小鼠伤后第1、3日创缘组织细胞中Connexin43、Pannexin1阳性表达（×200）Fig 3 Positive expressions of Connexin43 and Pannexin1 in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the first and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.5 创缘组织中CD39阳性表达的观察

通过免疫组织化学染色法标记CD39后发现，伤后第1日和第3日，DC组小鼠创缘组织细胞中CD39阳性表达量明显低于NC组（图4）。

图4 免疫组织化学法观察DC组和NC组小鼠伤后第1、3日创缘组织细胞中CD39阳性表达（×200）Fig 4 Positive expression of CD39 in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the fi rst and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.6 创缘组织中P2X7和P2Y2阳性表达的观察

研究[9-10]显示，P2X7和P2Y2受体主要表达于细胞膜。通过免疫组织化学染色标记P2X7和P2Y2受体观察其在创缘组织细胞中的阳性表达，伤后第1日和第3日，DC组小鼠创缘组织细胞中P2X7、P2Y2受体的阳性表达量均低于NC组（图5）。

图5 免疫组织化学法观察DC组和NC组小鼠伤后第1、3日创缘组织细胞中P2X7、P2Y2受体的阳性表达（×200）Fig 5 Positive expressions of P2X7 and P2Y2 receptors in tissues of wound margin of the DC and NC groups on the first and third day after being wounded by immunohistochemistry (×200)

2.7 创面愈合分析

通过动态观察各组小鼠创面愈合过程发现，与正常组小鼠相比，糖尿病组小鼠的创面愈合过程有明显延迟；而相较于DC组，DA组小鼠的糖尿病创面的愈合速度明显加快。经统计，随着时间的推移，4组小鼠的创面面积逐渐缩小（图6），愈合率从伤后第7日起出现明显差异；伤后第14日，DA组小鼠的创面愈合百分比为（86.630±4.200） %，显著高于DC组[ （72.390±2.862） %]（P=0.000），但仍低于NA组[ （98.998±1.650） %]（P=0.000），而NC组和NA组间差异无统计学意义（表2）。

图6 4组小鼠在不同时间点的创面愈合情况Fig 6 Wound healing conditions of the mice in the four groups at different time points

表2 4组小鼠伤后第1、3、7、14日的创面愈合率比较Tab 2 Wound healing rate on the fi rst, third, 7th and 14th days after being wounded in each group

2.8 组织学形态观察

于光学显微镜下观察各组小鼠伤后第7日的创缘组织显示，NC组和NA组小鼠的创缘组织可见大量新生肉芽组织及新生毛细血管，DC组小鼠创缘组织中仅可见少量肉芽组织，且胶原结构稀疏紊乱，血管样结构较少；而与DC组相比，DA组小鼠肉芽组织中胶原结构相对整齐且血管样结构较多，但仍不及NC和NA组（图7）。

图7 光学显微镜下观察4组小鼠伤后第7日创缘组织中肉芽组织生长和新生血管分布情况（×200，H-E染色）Fig 7 Growth of granulation tissue and distribution of neovascularization in the wound tissues of the mice in the four groups on the 7th day after being wounded by the light microscope (×200, H-E staining)

3 讨论

当外源性皮肤组织受损后，损伤刺激因子将启动炎症 - 修复 - 重塑进程，最终达到创面的愈合。研究[11-12]显示，组织细胞受损后会释放多种具有免疫调节活性的内源性物质，即损伤相关模式分子（damage associated molecular patterns，DAMPs），参与协同激活先天免疫系统及调节获得性免疫方向，对组织修复或异常重构进行调控。其中，ATP不仅是生理状态下维持细胞代谢功能的主要能量物质，应激状态下也可作为DAMPs分子实现对多种细胞效应的调控[13]。胞外ATP的主要来源有2种途径，即受损、坏死细胞的直接释放或特定信号介导的可控性释放[14-15]。一般来说，几乎所有组织细胞在特定的刺激下均可释放ATP至胞外[5,16-17]。同时，受损组织局部的高浓度ATP在嘌呤受体P2的介导下可趋化炎症细胞至创面组织启动炎症反应，从而参与急性炎症反应过程[18-20]；而后，胞外ATP在嘌呤转换酶CD39的作用下被水解为AMP或腺苷以终止P2信号[13]，且低浓度ATP或其降解产物（AMP和腺苷）可参与后续的组织修复重建过程[21-23]。作为创面愈合的起始阶段，炎症反应过程有效顺利的进行与创面的如期愈合直接关联[24]，那么在糖尿病创面早期炎症阶段，ATP代谢及嘌呤信号通路是否存在一定的异常呢？本研究通过免疫组织化学染色法观察发现，在糖尿病创面愈合的早期炎症阶段（伤后第1日），ATP释放通道蛋白（Pannexin1、Connexin43）、胞外ATP水解酶（CD39）及嘌呤信号受体P2（P2X7、P2Y2）的表达均较正常创面明显减少；通过UPLC-MS/MS检测发现，糖尿病创面组织中ATP、ADP及AMP的含量在伤后第1日低于正常创面；而在损伤早期给予小鼠创面外源性ATP后，则明显加快了糖尿病创面的愈合速度。继而提示，在急性损伤早期放大胞外ATP信号可在一定程度上加快糖尿病创面愈合。

前期研究[25-26]表明，相较于正常创面，糖尿病创面的早期炎症反应（伤后第1日）存在一定的不足，而在炎症转归阶段（伤后第3日），炎症消退也呈现出一定的迟滞。作为中性粒细胞脱颗粒的标志，MPO也是评价炎症反应强度的常用指标[27]。本研究通过对中性粒细胞计数并评估MPO水平来对比糖尿病创面与正常创面愈合过程中炎症反应的差别，结果显示：正常创面组织在伤后第1日可见大量中性粒细胞浸润，MPO水平较高，伤后第3日则中性粒细胞数量及MPO水平均下降；而与正常创面相比，糖尿病创面组织在伤后第1日的中性粒细胞数量及MPO水平均明显偏低，伤后第3日则反之。上述结果再次提示，糖尿病创面的早期炎症反应不足，启动时相较正常创面有所延迟，且炎症消退也较正常创面有所迟滞。

通过UPLC-MS/MS检测创面ATP及其代谢产物（ADP、AMP）含量发现，伤后第1日，糖尿病创面含量均低于正常创面组织。但由于检测方法的局限性，现有手段测定结果所显示的为胞内胞外总量，难以具体界定胞内和胞外ATP的相应含量，而真正起到启动急性炎症反应，诱导中性粒细胞氧化呼吸爆发的为胞外ATP[3]。因此，本研究进一步结合创缘组织中ATP释放通道蛋白、胞外ATP水解酶及嘌呤信号受体P2的表达来进行综合分析，间接评估胞外ATP的代谢水平。

皮肤组织损伤后，ATP不仅可以通过破损的细胞膜被动释放至损伤组织，还可通过细胞膜上的ATP释放通道进行可控性释放。Pannexin1和Connexin43是组织细胞中广泛表达的2种ATP释放通道蛋白，经其释放的ATP在中性粒细胞趋化过程中扮演着重要角色[28]。免疫组织化学染色结果显示，伤后第1、3日糖尿病创面组织细胞中Pannexin1和Connexin43阳性表达量明显低于正常创面，提示炎症反应阶段经通道释放至胞外的ATP相对较少。CD39又称外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1，ENTPD1），能够催化水解胞外ATP为ADP及AMP[13]。免疫组织化学染色结果显示，伤后第1、3日糖尿病创面组织细胞中CD39的阳性表达量亦明显低于正常创面，提示糖尿病创面中ATP的分解代谢能力也处于较低水平。综合上述结果发现，在炎症反应阶段相比于正常创面，糖尿病创面组织中胞外ATP代谢状态低迷。

研究[23]显示，组织中的胞外ATP主要通过激活嘌呤受体P2来激活嘌呤信号发挥作用，其也是调控炎症反应的重要信号。在创面愈合炎症反应阶段，胞外ATP激活P2Y2受体与中性粒细胞的趋化、迁移、激活及氧化呼吸爆发密切相关[29]；且被激活的P2X7受体可参与多种炎症细胞趋化因子和炎症介质的释放[30-32]。免疫组织化学染色结果显示，伤后第1、3日糖尿病创面组织细胞中P2Y2和P2X7受体的阳性表达量明显低于正常创面，提示在炎症反应阶段的嘌呤信号也呈低水平状态。

本研究通过进一步给予小鼠创面外源性ATP观察糖尿病小鼠创面愈合情况，结果发现，在伤后第14日糖尿病组小鼠的创面愈合速度虽然不及正常组小鼠，但DA组明显高于DC组，提示外源性补充ATP可在一定程度上加快糖尿病创面的愈合。同时，通过组织学观察伤后第7日各组小鼠的创面组织发现，DA组小鼠的新生血管数量较多且组织胶原排列更加整齐，提示外源性补充ATP可在一定程度上加速糖尿病创面的胶原沉积和血管新生。但上述情况与愈合早期炎症反应的时效性是否有直接联系，仍有待进一步的实验验证。

综上所述，在糖尿病创面愈合过程的炎症反应阶段，ATP代谢及嘌呤信号水平均呈低水平状态，外源性补充ATP可加速糖尿病创面的愈合；继而提示，胞外ATP代谢与创面炎症修复进程相关，且在急性损伤早期放大胞外ATP信号可促进糖尿病创面愈合。而究竟能否通过调控创面ATP代谢状态，放大糖尿病创面急性炎症期的嘌呤信号，以提高糖尿病创面炎症反应的时效性，将有待于后续研究进一步分析。