LC-MS/MS法测定比格犬血浆中匹莫范色林浓度及药代动力学研究

马婷婷，左琳，陈娇

(夸克侠医药科技<辽宁>有限公司生物分析中心，辽宁 本溪 117000)

帕金森病(PD)是最常见的神经退行性疾病之一，仅次于阿尔茨海默病[1]。帕金森病的主要特征是一系列被称为帕金森症的运动症状，包括震颤、肌强直、运动迟缓以及姿势平衡障碍[2]。研究发现，50%以上的PD患者会伴发错觉、幻觉、妄想等精神症状[3]。在疾病的初始阶段，左旋多巴是改善PD运动症状最有效的疗法，左旋多巴的治疗重点是缓解症状，恢复多巴胺水平，改善运动症状[4-6],但长期应用多巴胺制剂，会引发躁狂、视幻觉、妄想症和偏执症等精神病症副作用[7]。实验证明多巴胺激动剂的治疗方式可延缓运动障碍的发生。PD首选治疗方法为尽可能减少抗帕金森药物多巴胺剂量，联合抗精神病药对于治疗药物诱发的精神精神障碍有效[8-10]。由于大多数抗精神病药物在改善精神病方面具有相似的疗效，临床上在选用精神病药时主要考虑其不良反应。临床常用氯氮平，喹硫平治疗帕金森精神病，但是这两种药不良反应较大，氯氮平对帕金森病最常见的副作用是过度镇静、直立性低血压、流涎和粒细胞减少,并且证实氯氮平的使用与死亡率、癫痫发作、心肌炎和其他心血管和呼吸系统疾病的风险增加有关；喹硫平最常见的副作用为体位性低血压、过度镇静，与氯氮平相比，不能改善震颤[11-12]。由Acadia制药公司研发的治疗帕金森精神病的新型药物匹莫范色林，属于有效的5-HT2A反向激动剂,对 5- HT2A受体具有较高的亲和力,而对5- HT2C受体亲和力低，特别是对多巴胺D2受体或组胺受体几乎无作用[13-14]，与非典型抗精神病药物不同的是，匹莫范色林选择性高、耐受性好，即使在高剂量下也不会诱发过氧化氢症，或引起运动效应,无严重不良反应[15]。2016 年 4 月 29 日，匹莫范色林成为美国食品药品监督管理局(FDA)批准的首个用于治疗伴有幻觉和妄想等精神症状的帕金森病患者的药物[16]。

然而，匹莫范色林作为一种新药，药物动力学信息有限。目前关于匹莫范色林药物代谢动力学的系统研究较少，因此，更有必要对体内的药动学特征进行更进一步的研究。在本研究开发并验证了一种专属、灵敏、快速的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法，测定比格犬血浆中匹莫范色林的质量浓度，并将所验证的方法应用于匹莫范色林在比格犬体内的药代动力学研究[7]，为匹莫范色林在人体内的药代动力学研究提供参考依据。

1 材料

1.1 试剂与试药 匹莫范色林对照品(纯度为98.0%，中国食品药品检定研究院)；卡马西平对照品(纯度99.7%，中国食品药品检定研究院)；匹莫范色林片[17 mg/片，夸克侠医药(辽宁)有限公司]；乙腈(色谱纯，Sigma-Aldrich公司)，异丙醇(色谱纯，成都市科隆化学品有限公司)；甲酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲基叔丁基醚(色谱纯，成都市科龙化工试剂厂)；纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.2 实验动物 健康雄性比格犬8只，体重9.5～12.3 kg，购于北京玛斯生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0001；实验动物使用许可证号：SYXK(辽)2018-0009。实验动物房通风良好，装备空调，温度保持在16～26 ℃，湿度保持在40%～70%，明暗照明各12 h，每只比格犬均用耳部文身标记，并在笼具上标注试药编号与剂量。

2 方法与结果

2.1 给药方案与血样采集 健康比格犬8只，给药前禁食12 h，自由饮水。灌胃给药1片(剂量17 mg/片)。采用比格犬前肢隐静脉取血方式，受试者于给药前(0 h)及给药后5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、1.25 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h采血约0.5 mL，置于含肝素锂的采血管中，立即于4 ℃离心机以4 000 rpm离心10 min，取血浆-20 ℃冷冻保存。

2.2 色谱条件和质谱条件 色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；流动相A：水(含5%乙腈，0.1%甲酸)，流动相B：乙腈(含0.1%甲酸)，流速1.2 mL·min-1，梯度洗脱程序为：0 min，30%B；1 min，95%B；3.6 min，95%B；3.61 min，30%B；4.5 min，30%B。柱温40 ℃，自动进样器温度4 ℃，进样量为5 μL。

质谱方法：AB4500三重四级杆串联质谱仪(AB Sciex,USA)，离子源为ESI源，检测方式为正离子检测，扫描方式为多反应监测(MRM)方式，定量分析时的离子对分别为m/z： 428.4→223.2(匹莫范色林)、m/z：237.0→193.9(卡马西平，内标)，喷雾电压(IS)：5 500 V，源温度(TEM)：550 ℃，气帘气(CUR)：25 psi，雾化气(GS1,GS2)为55 psi，碰撞气(CAD)：8 V，质谱入口电压(EP)分别为10.00和8.83，去簇电压(DP)分别为110.0和100.0，碰撞能(CE)分别为25.0和29.0，碰撞室出口电压(CXP)分别为7.0和13.8。

2.3 标准溶液的制备 取匹莫范色林对照品约10 mg，精密称定，置于30 mL称量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀释至1.000 mg·mL-1。精密移取上述储备液适量，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀释，获得浓度为1、2、10、20、100、200、360和400 ng·mL-1的匹莫范色林标准工作溶液及浓度为3、40和320 ng·mL-1的质控(QC)工作溶液。取卡马西平对照品10 mg，精密称定，置于30 mL称量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀释至1.000 mg·mL-1的内标储备液。用纯净水将内标储备液逐级稀释至5 ng·mL-1的内标工作溶液。

2.4 血浆样品的制备 取待测血浆样本100 μL，加入内标工作溶液(含卡马西平：5 ng·mL-1)50 μL，涡旋1 min，加入1 mL甲基叔丁基醚，涡旋2 min，于10 ℃、10 000 rpm离心10 min。取上清液800 μL，于40 ℃真空离心浓缩至干燥。加入复溶剂(乙腈含1%甲酸)100 μL，涡旋2 min，取上清液5 μL进样分析。

2.5 方法学确证

2.5.1 选择性 分别取6个不同来源的比格犬空白血浆，按照“2.4”项下(无内标无待测物)的方法进行处理，进样分析。结果表明比格犬空白血浆样品中干扰组分的响应低于当批次LLOQ待测物响应均值的20%及内标响应均值的5%，比格犬血浆中的内源性物质不干扰分析物和内标的定量分析，该方法具有良好的专属性(见图1)。

图1 比格犬血浆中匹莫范色林(Ⅰ)和卡马西平(Ⅱ)的典型MRM色谱图

2.5.2 标准曲线和定量下限 精密量取空白血浆190 μL，分别加入匹莫范色林标准工作溶液各10 μL，配制成含匹莫范色林分别为0.05、0.1、0.5、1、5、10、18、20 ng·mL-1的标准曲线血浆样品，取出100 μL上述样本，其余过程依照“2.4”项下操作，进样分析。以待测物浓度为横坐标(X)、待测物与内标物的峰而积比值为纵坐标(Y)，采用加权最小二乘法(权重1/X2)进行回归运算，求得标准曲线方程。试验结果表明，匹莫范色林在0.05～20 ng·mL-1浓度范围内r均大于0.99，线性关系良好，定量下限为0.05 ng·mL-1。

2.5.3 精密度和准确度 精密量取空白血浆190 μL，分别加入匹莫范色林质控工作溶液各10 μL，配制成血浆中匹莫范色林浓度分别为0.15、2、16 ng·mL-1的质控样品，取出100 μL上述样本，其余过程参照“2.4”项下。取定量下限样品及低、中、高浓度质控样品进样分析，进行批内与批间精密度准确度和精密度考察。每个浓度6样本，连续考察3个分析批。考察结果见表1，精密度和准确度均满足生物样品定量测定的要求。

表1 批内和批间精密度和准确度试验结果

2.5.4 提取回收率和基质效应 采用低、中、高3个浓度的质控样品评估匹莫范色林的提取回收率与基质效应,正常处理的质控样品与来空白血浆(分别取6个不同个体的比格犬)提取后加入标准溶液的样品响应值的比值为提取回收率；空白血浆提取后加入标准溶液的样品与相同浓度标准溶液响应值的比值为基质效应。本试验所得基质效应值均经内标归一化校正。结果显示，低、中、高3个浓度质控样品提取回收率的均值分别为61.2%、62.4%，63.2%，同法考察得内标的提取回收率66.7%。低、中、高3个浓度的质控样品基质效应均值分别为1.017、1.026、1.000，表明基质效应可忽略不计。

2.5.5 样品稳定性 采用低、高2个浓度的质控样品考察比格犬血浆中匹莫范色林的稳定性，考察的条件分别为未处理血浆样品室温条件下放置20 h、处理后样品室温放置25 h、运输稳定性、自动进样器(4 ℃)放置48 h、冻融循环5次、-20 ℃长期稳定性(放置29 d)、-70 ℃长期稳定性(放置31 d)，依照“2.4”项下处理，各浓度水平进行6样本分析。试验结果见表2，表明低、高2个浓度的质控样品在各条件下，匹莫范色林浓度无明显变化，稳定性良好。

表2 低、高2个浓度的质控样品在不同条件下的稳定性

2.5.6 稀释可靠性 配制高于定量上限的血浆样本，加入空白血浆稀释5倍后参照“2.4”项下处理样品，进行6样本分析。试验结果表明，测得样品浓度的RE和CV%均小于15%，表明高浓度样本稀释5倍后测得的准确度良好。

2.5.7 残留效应 定量上限样品后注射空白样品来评估残留。结果显示，空白血浆样品中匹莫范色林响应值未超过当日检测定量下限最低响应值的20%，内标干扰物的最大响应值未超过当日检测内标平均响应值的5%，表明残留效应考察符合要求。

2.6 比格犬体内药代动力学研究 8只健康比格犬单剂量口服匹莫范色林片后平均血药浓度-时间曲线见图2。使用WinNonlin 6.1软件的NCA模块计算药动学参数，结果见表3。结果表明，平均Cmax为5.608 ng·mL-1，平均Tmax为0.83 h。AUC0～24 h和AUC0～∞个体差异较大，且与文献报道的受试者AUC0～24 h和AUC0～∞差异很大[17]，造成这种差异的原因可能是人与比格犬对匹莫范色林的吸收机制不同。因此有必要进一步研究匹莫范色林在不同物种间和同一物种不同剂量的药代动力学特征，进而论证其剂量与药代动力学和药效学的相关性。

图2 比格犬单剂量给药后匹莫范色林的平均血药浓度-时间曲线图

表3 单剂量口服给药后测得的药动学参数

3 讨论

本文首次建立了测定比格犬血浆中匹莫范色林的液相色谱-质谱/质谱法。本方法简单、灵敏及快速，成功应用于比格犬血浆中匹莫范色林的测定及其药代动力学研究，为进一步研究匹莫范色林的药理药效、剂型改良及其临床研究提供了实验依据。

方法开发过程中，发现该化合物在系统中的残留行为较为严重，为了降低残留效应，将流动相中甲醇更换为乙腈，增强洗脱能力；尝试不同洗脱能力的洗针液，分别为95%乙醇、异丙醇、混合溶液1(甲醇∶乙腈∶异丙醇∶水=1∶1∶1∶1，V∶V∶V∶V)、混合溶液2(甲醇∶乙腈∶异丙醇=1∶1∶1，V∶V∶V)，结果表明混合溶液2的洗脱能力较强，同时增加洗针程序中外洗时长，结果显示，优化后的方法能够有效控制残留效应，确保了残留不影响准确度和精密度。

考察了两种不同的生物样品前处理方法，蛋白沉淀法(PPT)和液液萃取法(LLE)。PPT法简便、快速，但此方法获得的生物样品化合物响应较低不能满足定量下限要求；而LLE法处理样品干净基质干扰少，且样品经过浓缩后化合物响应较高，确保使用该方法测定血浆样品时稳定、可靠。