千山活血膏治疗大鼠急性软组织损伤的作用研究

陈瑶，王洪林，安莉君，曹慧玲，郑国栋，郭远强

(1.南开大学药学院，天津 300350；2.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；3.北京修成药业有限公司，北京 100085)

急性软组织损伤是临床骨科常见和多发疾病之一，一般是指由于外力间接或直接作用于人体，造成的局部组织肿胀或微小血管的壁破裂[1]。无菌性炎症是急性软组织损伤后发生的最重要的病理变化[2]，临床上可以通过多种方式表现出损伤，包括局部肿胀、肌纤维断裂、疼痛、皮肤青紫瘀斑和肢体功能障碍等。有研究表明，受损处出血会导致缺氧、缺血，引起组织细胞有氧呼吸破坏，影响细胞线粒体中氧化磷酸化过程，从而导致ATP生成减少或停止，引起软组织损伤[3]。急性软组织损伤严重影响人们的健康和工作能力，如不及时治疗甚至可能导致患者自理能力受阻[4]，目前受到了越来越多研究者的重视。

中成药千山活血膏(国药准字Z20025596)是采用现代提取技术制备而成的摊于布上黑膏剂，由土鳖虫、大黄、三七、延胡索、血竭、续断、黄柏、乳香、没药、儿茶、细辛、千年健、山慈菇、泽泻、山羊角、木香、白及、白芷、桂枝、羌活、红丹、芝麻油共22味中药制备而成。土鳖虫、大黄、三七、延胡索、乳香、没药具有活血化瘀、舒筋活络、消肿止痛的功效，千年健可壮筋骨、止痛和消肿。千山活血膏可广泛用于肌肤关节肿胀、疼痛、活动不利，以及跌打损伤，腰、膝部骨性关节炎等症状者[5-6]。然而，目前还没有千山活血膏治疗急性软组织损伤的报道。

本研究通过构建急性软组织损伤大鼠模型，研究了千山活血膏用于治疗急性软组织损伤的疗效及其作用机制，为千山活血膏广泛推广于临床提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 90只雄性清洁级SD大鼠，体重(190 ± 10)g，均购于北京军事科学院动物中心，实验动物使用许可证号为：SYXK(津)2019-0001。所有大鼠均饲养于天津南开大学动物中心动物房，标准大鼠饲养笼(6只/笼)。饲养条件：人工照明(12 h光照/12 h黑暗)，相对湿度60%±10%，温度(25±2)℃。所有大鼠均自由饮食和饮水。适应性饲养1周后用于后续实验研究。

1.2 主要仪器 I2000型数字电子秤购于深圳市无限量衡器有限公司。JT-12S型自动组织脱水机购于武汉俊杰电子有限公司。BMJ-A型包埋机购于常州市中威电子仪器有限公司。HM525NX型石蜡切片机及MX35型超优刀片均购于赛默飞世尔科技公司。BX51型显微镜及DP70型照相系统均购于Olympus有限公司。LOGENE-I医用图像处理系统软件及Digital Imagine数字图像采集软件2.1版均购于无锡市朗珈生物医学工程有限公司。

1.3 药品与试剂 千山活血膏由北京修成药业有限公司提供；双氯芬酸二乙胺乳胶剂/扶他林(进口H20160648)购于中美天津史克制药有限公司；大鼠前列腺素E2(PGE2)酶联免疫法试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司；大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫法试剂盒均购于武汉博士德生物科技有限公司；乙醇及二甲苯均购于国药集团化学试剂有限公司；4%多聚甲醛、苏木素及伊红均购于湖北百奥斯生物有限公司。

1.4 急性软组织损伤大鼠模型的建立 造模前1 d，用剃毛刀剃除所有大鼠左侧臀部及大腿后侧毛，而后使用8%的硫化钠清除细小毛发，选择大腿中部外侧软组织做好标记。所有大鼠用10%的水合氯醛进行全身麻醉，将大鼠左下肢平放，固定于急性软组织损伤造模装置操作平板上；然后使用50 g砝码从100 cm高度空心管的顶部自由落体击中大鼠左下肢软组织，连续击打3次，打击部位出现面积约1 cm2的明显皮下出血及肿胀。肉眼观察，打击后出现肿胀、青紫、瘀斑，但无皮肤破损；单侧后肢跛行，但无骨折及脱位征，无其他异常情况发生，表明造模成功。

1.5 动物分组及给药 用自制软组织打击器建立急性软组织损伤大鼠模型，90只雄性SD大鼠随机分为模型组，扶他林(0.5 g /只/天)组和千山活血膏(0.5 g /只/天)组，每组30只大鼠，每天给药1次，连续15 d。造模后第1、4、7、15天分别记录各组大鼠的活动状态和体重。

1.6 指标检测 分别取造模后的第1、4、7、15天各组大鼠损伤组织，加入9倍体积的PBS进行匀浆，离心取上清液，采用酶联免疫法检测炎症因子TNF-α、IL-1β、PGE2的含量变化，步骤严格参照酶联免疫法试剂盒说明书进行。

1.7 病理组织学检查 分别取造模后第1、4、7、15天各组大鼠固定后的肌肉组织，常规石蜡包埋，切片厚 4～5 μm，进行 HE染色，显微镜下观察切片中组织出血情况、肌纤维以及炎性细胞浸润。

采用盲评法[7-8]分别对造模后第1、4、7、15天各组大鼠软组织损伤证候指数以及软组织病理切片进行评分(见表1)。

表1 软组织损伤评分标准

注：得分越高说明受损伤程度越严重

2 结果

2.1 千山活血膏对急性软组织损伤大鼠活动及体重的影响 造模后第1天，3组大鼠均不活跃，跛足前行。造模后第4天，扶他林组与千山活血膏组大鼠腿部损伤有所好转，活动较第1天稍有活跃，模型组无变化。造模后第7天，3组大鼠活动较为积极，模型组跛行明显，扶他林组与千山活血膏组大鼠跛行不明显。造模后第15天，模型组大鼠仍有部分跛行，扶他林组与千山活血膏组大鼠走动正常、活跃。

分别在造模后第1、4、7、15天记录各组大鼠体重变化，如图1。由此图可看出，各组大鼠体重增长趋势一致，软组织损伤并未对大鼠体重造成影响，各个时间点3组大鼠体重差异均无统计学意义。

2.2 千山活血膏对急性软组织损伤大鼠肌肉组织炎症因子的影响 如图2，与模型组相比，给药4 d后扶他林组和千山活血膏组均未对几种炎症因子的表达水平造成影响。而给药7 d和15 d后，扶他林组和千山活血膏组显著降低了TNF-α和IL-1β的水平。对于PGE2，扶他林与千山活血膏无论用药4 d，还是7、15 d均不能显著降低PGE2的含量，3组之间PGE2的含量差异无统计学意义。

图1 千山活血膏对急性软组织损伤大鼠体重的影响

图2 千山活血膏对急性软组织损伤大鼠炎症因子的影响(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)

2.3 软组织损伤症候指数评分结果 软组织损伤症候指数评分，如表2所示，结果表明，造模后1 d，3组大鼠软组织损伤症候指数评分差异无统计学意义，用药4 d后扶他林与千山活血膏均能显著改善软组织损伤，尤其是千山活血膏(P<0.01)。扶他林与千山活血膏差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 3组大鼠软组织损伤症候指数评分

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4 3组大鼠损伤组织形态学观察 分别取造模后第 1、4、7天损伤组织边缘处新鲜肌肉组织，制备石蜡切片，HE染色后在显微镜下观察组织病理学变化，如图3。造模后1 d，3组大鼠肌肉组织切片均可见大量或灶性出血，炎性细胞扩散、浸润，肌纤维间隙肿胀变形，组织溶解，细胞界限不清，肌纤维断裂变性坏死。造模后4 d，模型组仍有部分的炎性细胞浸润，两给药组可见炎症细胞少量散在分布，组织水肿及出血较之前减轻；肌纤维间隙虽肿胀，但出血肌肉纤维断裂坏死有所改善，肌纤维排列稍恢复。造模后7 d，模型组肌纤维排列紊乱，肌纤维间隙稍肿胀，较多炎性细胞浸润，散在灶性出血。扶他林组和千山活血膏组损伤肌纤维变性、坏死、肌纤维间质炎性细胞浸润的情况被显著改善。造模后15 d，模型组仍见细胞间质出血，少量炎性细胞浸润；千山活血膏组和扶他林组肌纤维间隙组织间液中基本未见炎性细胞，无毛细血管扩张、充血，无纤维断裂情况，细胞间隙明显，成纤维细胞增多。

图3 千山活血膏治疗急性软组织损伤大鼠组织形态学变化(100×)

此外，我们对3组大鼠软组织进行病理评分，如表3。造模后7 d和15 d，与模型组相比，扶他林组和千山活血膏组病理评分均显著降低，这进一步表明了千山活血膏对损伤大鼠有良好的治疗效果。

表3 3组大鼠软组织切片病理评分

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

急性软组织损伤作为一种常见的骨科疾病，以皮肤下组织，包括肌肉、韧带、筋膜、肌腱、滑膜、脂肪、关节囊外周神经和血管，但不包括骨骼中的一系列急性挫伤或撕裂，为特征[9]。急性软组织损伤通常由外力引起局部肿胀、疼痛、功能障碍和瘀伤等症状，其主要病理变化参与外伤性无菌性炎症反应，以局部组织坏死、毛细血管扩张、白细胞浸润、水肿和出血为表现。软组织损伤属于中医学“筋伤”范畴，“气滞血瘀、血溢脉外、脉络不通”是传统医学对软组织损伤的病机认识。如《疡医大全》所描述，“有跌伤骨伤，治法宜活血祛瘀为先，血不活则瘀不去，瘀不去则骨不能接也”。中医外用药常用于治疗软组织损伤，在我国历史悠久，一方面价格低廉、使用方便；另一方面局部用药，疗效确切、药力可直达病所。研究表明，药物透皮吸收给药具有避免肝脏的首过效应、避免对胃肠道刺激、延长有效作用时间、给药方法简单等优点[10]。因此，经皮给药逐渐受到越来越多研究者的重视和青睐。

最近研究表明，急性软组织损伤模型被广泛用于研究众多药物的抗炎作用[11-12]。尽管其病因与临床急性软组织损伤的病因会有所差别，但其病理和临床病理表现相似[11]。本研究使用50 g砝码从100 cm高度空心管的顶部自由落体击中大鼠左下肢软组织，模拟临床急性软组织损伤的发生，建立急性软组织损伤的大鼠模型，探究千山活血膏对急性软组织损伤的治疗效果。分析大鼠活动状态及体重结果表明，软组织损伤以及千山活血膏药物的使用均并未对大鼠体重造成影响，千山活血膏却能显著改善急性软组织损伤大鼠活动状态。

现代医学认为，机体受到损伤会引起游离神经末梢周围组织产生充血水肿等炎症反应。软组织损伤会引起局部炎症反应，释放一系列炎症因子、致痛性炎症介质，可直接导致疼痛，炎症局部的肿胀压迫神经末梢也可引起疼痛。PGE2是重要的炎症介质，能够降低痛阈，在创伤中起重要作用[13]。TNF-α、IL-1β是两个主要的促炎细胞因子，参与炎症反应早期[14-15]。TNF-α能够促进其他炎性细胞因子如IL-1β、IL-6等的产生，进而引起连锁反应，使机体产生过度炎症反应。IL-1β是炎症反应中重要的促炎因子，未受到损伤时，IL-1β在体内的含量较低，当组织受到损伤时，IL-1β的含量急剧上升，因此血液及局部组织中的IL-1β含量可作为炎症的严重程度的判断标准。研究表明，中成药三七活血片能显著降低急性软组织损伤大鼠组织PGE2含量[1]。中成药金黄凝胶也能显著降低急性软组织损伤大鼠血清PGE2含量[16]。与前人研究不同，本研究3组之间PGE2的含量无统计学意义，本结果提示千山活血膏没有介导炎症因子PGE2参与急性软组织损伤。分析其原因主要是因为膏药黏在大鼠腿上，每日清理会对其造成一定的疼痛，导致PGE2含量变化不明显。对于炎症因子TNF-α、IL-1β，千山活血膏表现出与扶他林相同的抗炎消肿效果，与前人研究结果相似[16-18]。纪春梅等[19]研究表明扶他林治疗急性软组织疼痛取得良好的效果。本结果提示千山活血膏可能是通过调控TNF-α、IL-1β炎症因子发挥作用，从而改善急性软组织损伤。

此外，软组织损伤症候指数评分、组织病理学分析结果与组间TNF-α、IL-1β含量变化一致，也与前人研究结论一致[16,20]，以上有力地支持了我们的结论。造模后用药7 d及用药15 d，千山活血膏表现出与扶他林治疗急性软组织损伤相似的疗效，千山活血膏组大鼠软组织损伤症候指数评分、组织病理学评分均与伤扶他组差异无统计学意义。本实验也存在一定的局限性，虽验证了千山活血膏对于大鼠的急性软组织挫伤的治疗机制可能是通过调节其炎症因子，但并未确切的进行调节通路以及其他可能调节蛋白的研究。进一步检测血液流变学等方面的指标，仍具有重要意义。

总之，本研究阐明了千山活血膏治疗急性软组织挫伤的可能机制，同时为千山活血膏临床治疗的疗效以及治疗周期提供了科学的依据。本研究表明千山活血膏对治疗急性软组织损伤具有较好的疗效，其可能是通过调控TNF-α、IL-1β炎症因子发挥作用，从而改善急性软组织损伤。千山活血膏具有与扶他林相似的抗炎消肿效果，值得在临床上推广。