水溶性荧光探针的合成及对亚硫酸氢根和pH值的双重检测

戚少龙 杜建时* 李容杭 李 强 祝录宝 时亚男王欣宇 杨清彪* 张桂荣 李耀先

1(吉林大学中日联谊医院, 吉林省淋巴外科重点实验室, 吉林省淋巴外科工程实验室, 长春 130031)2(吉林大学化学学院, 长春 130061) 3(吉林大学生命科学学院, 长春 130061)4(吉林大学第二医院, 长春 130041)

1 引 言

SO2是主要的大气污染物之一，被吸入人体后很快转化成亚硫酸(氢)盐，引起眼、鼻、口腔粘膜等刺激症状，严重者还会引发呼吸道炎症、缺氧性肺动脉高压、肺癌和许多神经系统疾病[1～3]。同时，作为SO2的主要衍生物，亚硫酸(氢)盐是重要的抗氧化剂和防腐剂，广泛用于食品、药品、酒水、化妆品中，进入人体会引发多种疾病，被世界卫生组织和国际癌症研究机构列为第三类致癌物，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织建议，人体内亚硫酸氢盐水平应低于0.7 mg/kg[4]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Bruker AV-400MHz型核磁共振波谱仪(四甲基硅烷(TMS)为内标)、Bruker Agilent 1290-micrOTOF QII型质谱仪器(瑞士Bruker仪器公司); Hitachi F-4500型荧光光谱仪、Hitachi U-3010型紫外-可见吸收光谱仪(日本日立公司); X-5型显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司); PHS-3C型数显酸度计(上海雷磁仪器厂); LX-100手掌型离心机(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司); CO2细胞培养箱(美国Thermo 公司); OPTEC.BDSZW-PH倒置显微镜(重庆奥特公司); 超纯水制备系统(四川优普超纯科技有限公司); 精密电子天平(赛多利斯仪器系统有限公司); LSM710激光共聚焦显微镜(德国ZEISS公司)。

2,3,3-三甲基吲哚、1,3-丙磺酸内酯、苯甲醛、对羟基苯酚、4-羟基-1-萘甲醛等试剂均购自安耐吉化学试剂公司; 其它溶剂及无机盐均为市售分析纯试剂。96孔细胞培养板(无锡耐思生物科技有限公司); 一次性滤器(美国Millipore生物公司); 细胞培养瓶(康宁生命科学有限公司); Hela细胞(吉林大学生命科学公共技术中心); DMEM(dulbecco's modified eagle medium)高糖培养基(美国Gibco公司); 特级胎牛血清(Biological Industries公司); 胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索莱宝科技有限公司); 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT, 美国Amresco公司); 细胞培养皿(无锡耐思生物科技有限公司)。

2.2 实验方法

2.2.1 探针的合成探针ISND的合成: 将化合物1(0.56 g， 2 mmol)、4-羟基-1-萘甲醛(0.41 g， 2.4 mmol)溶于乙醇，回流搅拌24 h，待反应完成后，冷却到室温，过滤得红色固体，柱层析分离(二氯甲烷-甲醇, 20∶1，V/V)， 得紫色固体0.61 g，即为分子探针ISND，产率67%。1H NMR (400 MHz, DMSO)δ7.92 (ddd,J=29.8, 24.4, 7.3 Hz, 5H), 7.63 (dd,J=10.0, 5.5 Hz, 4H), 7.21 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.82 (s, 1H), 4.69～4.62 (m, 2H), 2.16 (dd,J=15.5, 8.3 Hz, 2H), 1.87 (s, 2H), 1.53 (s, 6H)。13C NMR (101 MHz, D2O)δ183.12, 169.06, 166.29, 141.55, 139.02, 136.01, 129.09, 120.03, 116.44, 96.32, 57.42, 47.81, 47.38, 28.16, 22.17, 16.84。ESI-MS (m/z): [M+H]+calcd for [C25H25NO4S]+, 436.1577; Found, 436.1562(详见电子版文后支持信息图S1～S3)。探针ISBD和ISPD的制备方法类似(具体合成过程见电子版文后支持信息示意图 1，相关化学表征核磁H谱、C谱、高分辨质谱见电子版文后支持信息图S4～S11)。

2.2.2 溶液的配制磷酸盐缓冲溶液(PBS)的配制: 称取1.79 g Na2HPO4、0.136 g KH2PO4、4.0 g NaCl和0.1 g KCl，用超纯水溶解并定容至500 mL。采用HCl或NaOH调至pH 1.0～12.0。

Yu=Ys(Fu/Fs)(As/Au)

(1)

其中，Yu和Ys分别为待测物质和参比标准物质的荧光量子产率;Fu和Fs分别为待测物质和参比物质的积分荧光强度;Au和As分别为待测物质和参比物质在该激发波长的入射光的吸光度。

2.2.4 细胞毒性实验取对数生长期的Hela细胞，稀释成1.0×104cell/mL的细胞悬液，接种到96孔板中，每孔100L，孵育24 h。加入浓度为0、5、10、15、20、25和30mol/L的探针ISND溶液(DMEM高糖培养基为溶剂)，孵育24 h。利用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法测定490 nm处吸光度值，根据公式(2)计算细胞存活率(Viability,V)。

V(%)=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%

(2)

其中，As为实验组吸光度值，Ac为对照组吸光度值，Ab为空白组吸光度值。

2.2.5 细胞荧光成像取对数生长期的Hela细胞，稀释成2.0×104cell/mL的细胞悬液，接种到培养皿中，每孔2 mL，孵育24 h。待细胞贴壁后，移除培养基，PBS冲洗细胞3次。以DMEM培养基配制探针ISND溶液(10mol/L)， 37℃ 5% CO2孵箱中孵育30 min。用PBS冲洗去除多余的探针ISND，利用共聚焦荧光显微镜观察细胞形态及荧光成像。上述细胞体系中加入(摩尔比是8, 8 eq)，孵育1 h。利用激光共聚焦显微镜观察细胞成像。

3 结果与讨论

3.1 探针的光谱性能

表1 探针ISBD、ISPD和ISND的结构式及光谱性质

Table 1 Optics property and chemical structure of the probe ISBD, ISPD and ISND

3.2 探针ISND对pH值的响应性能

首先进行了探针ISND对不同pH值PBS缓冲溶液(pH=1.0-12.0)的紫外-可见光吸收光谱及荧光光谱的滴定实验。探针ISND的紫外-可见吸收光谱随pH值变化曲线见电子版文后支持信息图S14，探针在581 nm和475 nm处出现两个吸收峰，最大吸收峰位于581 nm，并且吸收峰值随pH值的增加而不断升高，在475 nm处的吸收峰则随pH值的增加而逐渐降低，并在505 nm处拥有等吸收点。当探针 ISND溶液的pH值逐渐升高时，溶液的颜色由橙黄色逐渐变为紫红色。荧光光谱如图1A所示，探针 ISND在565 nm处的荧光强度随pH值的升高而不断增强(pH 2.0～8.0)，与对应pH值呈良好线性关系(图1B)。当pH<2.0或pH>8.0时其荧光强度趋于稳定。在365 nm紫外灯照射下，荧光则由橙色逐渐变为紫红色。以上实验结果表明，在pH 2.0～8.0范围内，探针ISND对pH值具有良好响应，能够实现pH值的精准检测。

图1 (A)不同pH值的PBS缓冲溶液中，1.0×10-5 mol/L探针ISND的荧光光谱的变化情况(狭缝: 5 nm/10 nm)，插图为在365 nm紫外光照射下，不同pH值的探针溶液的荧光变化; (B)探针ISND在565 nm处荧光强度与pH值的线性关系。Fig.1 (A) Fluorescence spectra of 1.0×10-5 mol/L ISND probe in phosphate buffer solution (PBS) with various pH values (slits: 5 nm/10 nm). Inset is picture of corresponding solution under 365 nm ultraviolet light; (B) Linear relationship between fluorescence intensity of the probe ISND at 565 nm and pH value.

3.3 探针ISND对的检测性能

图2 加入前(a)后(b)，探针ISND(1.0×10-5 mol/L)荧光强度随溶液pH值的变化，溶剂为PBS缓冲溶液，激发波长为282 nmFig.2 Fluorescence intensity of probe ISND(1.0×10-5 mol/L)versus pH value of PBS solution in the absence and presence of λex=282 nm

图3 (A)探针ISND的荧光发射光谱随的浓度变化情况(0～8 eq)(狭缝: 10 nm/10 nm, 溶剂: pH=7.4的PBS缓冲溶液)， 插图为365 nm紫外光下的照片; (B)探针ISND溶液荧光强度比 (F/F0) 与浓度的校正曲线Fig.3 (A) Fluorescence spectra of probe ISND (1.0×10-5 mol/L) in the presence of different concentrations of (0-8 eq) in PBS solution, pH=7.4. Inset is optical picture under 365 nm UV light; (B) Linear relationship of fluorescence intensity ratio (F/F0) versus concentration of

图4 不同离子存在下探针ISND荧光强度的变化Fig.4 Fluorescence response of probe ISND (1.0×10-5mol/L) in the presence of (8 eq) with other anions (80 eq)0. 1. F-; 2. Cl-; 3. Br-; 4. I-; 5. 6. 7. S2-; 8. SCN-; 9. ClO-; 10. 11. 12. OAc-; 13. 14. Cys; 15. Hcy; 16. GSH; 17. CN-. Concentration of ISND is 1.0×10-5 mol/L. Concentration of is 8.0×10-5 mol/L (8.0 eq). Concentration of each other substance is 8.0×10-4 mol/L (80 eq) respectively.

3.4 检测机理

图5 探针ISND对的检测机理: a、b、c、d为反应物相应位置的核磁质子峰; a1、a2、b1、c1、d1为产物相应位置的核磁质子峰Fig.5 Proposed sensing mechanism of ISND for detection of a, b, c and d respectively represent the NMR proton peaks at the corresponding positions of the reactants. a1, a2, b1, c1 and d1 represent the NMR proton peaks at the corresponding positions of the products, respectively

3.5 实际样品分析

图6 MTT法测定Hela细胞与探针ISND共孵育24 h后的存活率, C为对照Fig.6 Viability of HeLa cell after incubated with probes ISND by MTT method, C represents control sample

3.6 探针ISND的细胞毒性实验

采用MTT法检测了探针的细胞毒性。如图6所示，HeLa细胞与不同浓度的ISND(5～30mol/L)溶液孵育24 h后，仍然呈现良好的细胞形态，细胞存活率大于90%，表明探针ISND具有良好的生物相容性和低细胞毒性。

3.7 探针ISND的细胞成像实验

图7 (A) Hela细胞与探针ISND(1.0×10-5 mol/L)共孵育30 min后的荧光共聚焦显微镜图像; (B) 再加入饱和当量(8 eq)共孵育1h后的荧光共聚焦显微镜图像(激发波长405 nm)。左: 荧光图像; 中: 明场图像; 右: 重叠图像Fig.7 Confocal fluorescence microscopy imags of (A) living Hela cells incubated with probe ISND (1.0×10-5 mol/L), and (B) further incubated with 8 eq λex=405 nm. Left: fluorescence image; middle: bright field image; right: merged image

4 结 论