分子模拟研究壳聚糖-氮化硼纳米管封装及输运阿霉素

李嘉辰，俞斌，王琦，张丽

（1 浙江大学化学系，浙江杭州310029； 2 浙江理工大学理学院，浙江杭州310018）

引 言

纳米管材料由于具有空腔管体结构、能跨越生物体的多重屏障等特点，被广泛地应用于药物输运的研究[1-4]。相比于碳纳米管（CNTs），氮化硼纳米管(BNNTs)由于具有较高的化学稳定性和良好的生物相容性，在药物输运领域受到广泛的关注[3-6]。例如，Li 等[5]报道由BNNTs 构建的薄膜可以改善人类原代乳腺成纤维细胞和转化的乳腺细胞系的增殖。Chen 等[6]研究发现，BNNTs 能作为载体将寡聚DNA输运到细胞内部并且没有发现BNNTs 具有明显细胞毒性。现有研究结果表明BNNTs 在药物输运系统中存在潜在应用前景。

然而由于BNNTs 具有较大比表面积和较高化学稳定性，BNNTs 常通过π-π 堆积的方式聚集且难于分散，限制了其应用[7]。有效提高BNNTs的分散性对于将BNNTs 应用于药物输运领域具有重要意义。由于壳聚糖及其衍生物在低pH 溶液中显示出生物降解性、细胞膜黏附性和易质子化等优点[8-11]，通过引入壳聚糖及其衍生物可以进一步提高BNNTs 的分散性和生物相容性[11]。此外由于生物系统中的pH 水平不同（例如，癌细胞周围pH 较低[12-13]），质子化壳聚糖还能够与某些肿瘤细胞表面的多糖受体结合，提高载体的有效靶向性[14]。壳聚糖及其衍生物可作为pH 敏感载体将药物分子递送到靶细胞中[15-17]。因此，壳聚糖-BNNTs 复合载体在药物输运领域存在潜在的应用前景。

近年来，分子动力学模拟（MD）的方法可以在原子及分子水平提供许多现阶段实验还无法观测的信息，从而为解释药物靶向输运机制和载体材料分子设计提供依据[18-20]。本课题组在之前利用MD 研究结果表明，壳聚糖与BNNTs 的作用方式受到壳聚糖骨架上官能团以及BNNTs 管径大小的影响。非质子化壳聚糖可以通过BNNTs 管径调节快速自发地进入BNNTs 管中，而质子化壳聚糖由于周围有序水化层，会影响进入管中的动力学过程[20]。这为利用壳聚糖封装药物进入BNNTs 提供理论依据。本文主要通过MD 方法，以抗癌药物阿霉素DOX 为药物模型，揭示利用壳聚糖-BNNTs 复合载体材料封装及输运抗癌药物的可行性。该研究将为基于BNNTs 的药物载体材料的设计与应用提供理论指导及依据。

1 模拟方法

1.1 模型及力场构建

如图1所示，通过替换多糖上的—OH，构建2种10 聚的壳聚糖模型：完全脱乙酰化的壳聚糖（—NH2chitosan,CS_A10）以及完全脱乙酰化且质子化的壳聚糖(—NH3+chitosan, CS_B10)。功能化基团参数包括非键参数及壳聚糖单元之间的成键参数，键连、角度、二面角等参数来自Ferreira 等[21]的工作。非键参数通过Gaussian03 软件[22]，采用HF/6-31G+的方法，分别优化2 种含不同官能团（—NH2和—NH3+）壳聚糖单体结构得到。

图1 10聚壳聚糖模型，由替换多糖—OH获得（所有原子以licorice模型显示）Fig.1 Initial structure of chitosan with 10 units was generated by replacing glucose unit—OH group into—NH2 and—NH3+groups,respectively

阿霉素(doxorubicin,DOX)是一种常用广谱抗癌药物。本文以DOX 为药物模型，揭示利用壳聚糖-BNNTs 输运抗癌药物的可行性。DOX 电荷通过Gaussian03软件[22]，采用HF/6-31G+的方法获得。

结合本课题组之前壳聚糖BNNTS 复合材料的研究，本工作探讨利用BNNT (14,14)封装壳聚糖和DOX 的可行性。如图1(c)所示，BNNT(14,14)模型通过VMD 软件nanotube-build 模块构建[23]。BNNT(14,14) 使 用AMBER-GAFF 力 场，其 中BNNT (14,14) 电荷以及LJ 作用参数来自Aluru 等[24]的工作。BNNT(14,14)中硼和氮原子电荷参数分别为+0.300和-0.300；LJ 参数包括sigma (nm)和epsilon (kJ/mol)分 别 为 硼 原 子：0.337 和0.602；氮 原 子：0.345 和0.393。

棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,POPC)常用于模拟细胞膜磷脂双分子层。磷脂双分子层的结构文件以及AMBER-GAFF 力场形式POPC 的力场文件由lipidbook 网站下载。磷脂双分子层由上下2×256个POPC组成。

1.2 模拟细节

1.2.1 壳聚糖-BNNTs 封装DOX 壳聚糖-BNNTs封装DOX的模拟初始构型截图如图2(a)所示。首先获得了CS_A10/DOX 的构型。然后将CS_A10/DOX 的构型放置在BNNT(14,14)管口，进行壳聚糖-BNNTs封装DOX 的模拟。模拟系统置于9 nm × 9 nm× 17 nm 的水盒子当中，水分子采用TIP3P 模型。模拟过程采用周期性边界条件，模拟步长为2 fs。采用PME的方法[25]计算静电作用并且范德华作用截断半径为1.2 nm。通过Lorentz-Berthelot 的方法[26]计算不同原子之间的LJ 作用势。模拟中通过velocity rescaling 方法[27]控制温度为300 K，并且将BNNTs 固定住。模拟系统先进行5000 步的能量优化然后进行较长时间的NVT模拟。

图2 壳聚糖-BNNTs封装(a)及跨膜输运(b)DOX的初始构型截图（CS_B10壳聚糖为licorice模型，POPC为line模型，BNNT为licorice模型，DOX为vdW模型；截图中没有显示水分子和反离子）Fig.2 Initial structure of encapsulation(a)and transmembrane transport(b)of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

1.2.2 壳聚糖-BNNTs 跨膜输运DOX 人体肿瘤细胞环境pH 较低，壳聚糖在低pH 条件下易质子化。Thomas 等[28]报道BNNTs 能自发嵌入并稳定存在于磷脂双分子层中。为研究癌细胞环境利用壳聚糖-BNNTs 跨膜输运DOX，如图2(b) 所示，将得到的稳定CS_A10/DOX/BNNT 构型替换为完全质子化状态的CS_B10/DOX/BNNT 构型，并且将CS_B10/DOX/BNNT 的构型部分嵌入到磷脂双分子层之中。壳聚糖-BNNTs 跨膜输运DOX 时，模拟盒子大小为10 nm×10 nm×12 nm。

1.2.3 平均力势（potential mean of force，PMF）自由能计算 通过umbrella sampling 方法[29]计算一个单元—NH2壳聚糖与BNNT (14,14)以及DOX 与BNNT(14,14)之间的PMF。PMF 计算时，施加距离限制。以BNNT (14,14)为中心，反应路径为—NH2壳聚糖/DOX 与BNNT(14,14)之间的质心距离。质心距离限制时，简谐势力常数为3000 kJ/(mol· nm2)。采样窗口间隔距离为0.05 nm，一条完整PMF 曲线采样共计60 个窗口。其中，每个窗口进行10 ns 的分子动力学模拟，取数据后5 ns 用于PMF 分析。PMF 分析时，采用WHAM 方法[30]去除额外施加的谐振势的影响。

2 实验结果与讨论

2.1 壳聚糖-BNNTs封装DOX

BNNTs 由于具有空腔管体结构，能跨越生物体的多重屏障等特点，被广泛地应用于药物输运的研究领域[3-4,6]。利用BNNTs 空腔管体结构，将抗癌药物封装到BNNTs 管道中可以提高抗癌药物利用率并有效降低其毒副作用。模拟进行前将CS_A10/DOX 的构型放置在BNNT(14,14)管口，通过分子动力学模拟探讨壳聚糖-BNNTs 封装DOX 的可行性。如图3所示，30 ns瞬时构型图中可以看出，CS_A10壳聚糖与DOX能完全进入管中。图3中统计CS_A10壳聚糖/DOX 与BNNT(14,14)质心距离随时间的变化。可以看出，模拟5 ns 内壳聚糖/DOX 与BNNT(14,14)之间的距离迅速下降，最后在0 左右波动。结果表明，壳聚糖-BNNTs 复合载体能够迅速封装DOX，存在潜在的应用前景。

如图4 所示，计算一个单元—NH2壳聚糖与BNNT (14,14)以及DOX 与BNNT (14,14)之间的PMF，进一步研究DOX 封装过程。—NH2壳聚糖以及DOX 从管口2 nm 到管中心0 nm 时,进入管中的自由能逐渐降低。也可以发现，一个单元—NH2壳聚糖以及DOX 穿过管中心的自由能分别为-11 和-56 kJ/mol。自由能结果表明，壳聚糖以及DOX 存在进入管中的趋势。更多单元的壳聚糖进一步提供进入管中的驱动力。然而本课题组最近研究发现[20]，质子化壳聚糖需要很长时间才能进入管中。尽管自由能有利于质子化壳聚糖进入管中，但BNNT 管中[图5(a) Ⅰ所示]以及质子化壳聚糖周围存在的有序分布水化层，会影响壳聚糖进入的动力学过程以及封装效率。DOX 尺寸较大，类似质子化壳聚糖也会影响进入动力学过程。为此，如图5 所示，通过牵引不同固定取向DOX 进入管中，进一步分析所施加外力随时间的变化。可以发现当DOX共轭环相对xy面水平（horizontal）进入管口后，牵引力出现明显峰值且远大于以竖直（vertical）方式进入管中。表明DOX 需要调整构象才能进入管中。图3(b)中也显示，壳聚糖携带DOX 进入管中时，能够吸附固定且调整DOX 以合适的角度进入管中。因此，壳聚糖携带DOX 进入管中时，壳聚糖存在特殊优势：一方面能提供进入驱动力，另一方面能调整DOX以合适构象进入管中。

图3 (a)CS_A10壳聚糖/DOX与BNNT(14,14)质心距离随时间的变化；(b)体系初始以及30 ns 瞬时构型图Fig.3 (a)Center of mass(COM)distance between CS_A10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)snapshot of system at 0 and 30 ns

图4 一个单元—NH2壳聚糖与BNNT(14,14)以及DOX与BNNT(14,14)之间的PMF（坐标0为管中心位置，虚线为管口位置）Fig.4 Potential of mean force(PMF)of—NH2 and DOX passing through BNNT(14,14)[The reaction coordinate is along the central axis of BNNTs.0 nm is the middle location of the tube and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

图5 (a)Ⅰ:BNNT(14,14)管中水的xy平面密度分布图；不同取向DOX的初始构型，Ⅱ:DOX共轭环相对xy面竖直（vertical）放置；Ⅲ:水平（horizontal）放置；(b)牵引不同取向DOX进入管中所施加外力随时间的变化（牵引速率为0.01 nm/ps，虚线表示管口位置）Fig.5 (a)Ⅰ:Density map of water molecules in BNNT(14,14)in xy plane;DOX with different orientations in xy plane,Ⅱ:vertical;Ⅲ:horizontal;(b)external force on DOX versus simulation time[the pull rate is 0.01 nm/ps and the dotted lines represent the end location of BNNT(14,14)]

2.2 壳聚糖-BNNTs跨膜输运DOX

为实现壳聚糖-BNNTs 复合载体在药物输运领域的应用，从分子水平理解壳聚糖-BNNTs 复合载体材料与生物体及药物之间相互作用具有重要的意义，而细胞膜是生物体中药物输运过程的重要屏障。基于此本文探讨了壳聚糖-BNNTs 复合载体跨膜输运DOX 过程的可行性。跨膜输运DOX 时，考虑到肿瘤低pH 环境，选择将CS_A10/DOX/BNNT 构型，替换为完全质子化状态的CS_B10/DOX/BNNT构型。

从图6 所示的瞬时构型图可以发现BNNT (14,14)管随模拟时间增长不断陷入并最终完全进入到磷脂双分子层（POPC）中。图7(a)为POPC/CS_B10壳聚糖/DOX 与BNNT(14,14)质心距离随时间的变化。BNNT (14,14)管与POPC 的距离最初为2.5 nm。随着模拟时间的不断增长，BNNT(14,14)管与POPC 的距离不断下降，10 ns 后下降到并最终稳定在0 nm左右。即BNNTs 能稳定存在于POPC 中，该结果与Thomas 等[28]研究结果较好吻合，他们指出BNNTs 能自发嵌入并稳定存在于磷脂双分子层中。此外从图6 所示的瞬时构型图中不难发现，随着模拟时间的不断增长，CS_B10壳聚糖从管中逐渐脱离并最终稳定吸附于POPC 表面。DOX 也由BNNT (14,14)管底部最终上升到管顶部。图7(a)也显示CS_B10壳聚糖/DOX与BNNT(14,14)管中心的距离快速上升。

图6 壳聚糖-BNNTs复合载体跨细胞膜输运DOX的瞬时构型图Fig.6 Snapshot of transmembrane transport of DOX by chitosan-BNNT(14,14)

图7 (a)POPC/CS_B10壳聚糖/DOX与BNNT(14,14)质心距离随时间的变化；(b)CS_B10壳聚糖/DOX/PO与BNNT(14,14)相互作用能随时间的变化（PO表示单个进入管中的POPC分子）；(c)BNNT(14,14)管中随时间的模拟细节截图（虚线为POPC的中心位置）Fig.7 (a)COM distance between POPC/CS_B10/DOX and BNNT(14,14)versus simulation time;(b)interaction energy between CS_B10/DOX/PO and BNNT(14,14);(c)snapshot in BNNT(14,14)(the dotted line is the center of POPC)

图7(c) 为BNNT (14,14)管中过程细节图，随着BNNT(14,14)管不断陷入POPC 中，2 ns 左右管中进入一个完整的磷脂分子。而随着磷脂分子的进入，由于管中空间有限，CS_B10壳聚糖以及DOX 被不断向上排挤。为验证这一结果，分别统计CS_B10壳聚糖、DOX 以及PO（进入管中的磷脂分子）与BNNT(14,14)相互作用能随时间的变化，结果如图7(b) 所示。从图中可知PO与BNNT(14,14)相互作用最强，即磷脂分子能稳定存在于BNNT(14,14)管中。此外POPC 与BNNT (14,14)的较强疏水作用使得BNNT(14,14)不断陷入POPC中，管中磷脂分子因而能不断向上逐渐排挤CS_B10壳聚糖以及DOX。而随着CS_B10壳聚糖不断被挤出管中，CS_B10壳聚糖与BNNT(14,14)相互作用逐渐减弱为0，CS_B10壳聚糖完全脱离BNNT (14,14)管，DOX 上升到BNNT (14,14)上方。该结果表明，壳聚糖-BNNTs 跨膜输运阿霉素时，管中吸附物质能被细胞膜磷脂分子挤出或者存在离开管中趋势。这为后续实验设计提供思路：即可以提高管中封装药物浓度，当跨膜输运时，药物可以被磷脂分子挤出，进一步提高肿瘤部位给药浓度。

3 结 论

本文采用分子动力学模拟方法，对壳聚糖-BNNTs复合载体封装以及跨膜输运DOX 进行研究，得到以下结论。

（1）PMF 自由能显示DOX 以及非质子化壳聚糖存在自发进入管中趋势，通过施加力变化分析发现DOX 以不同构象进入管中难易程度不同。结果表明，非质子化壳聚糖能提供DOX 进入管中驱动力，并吸附且调整DOX 以合适的构象进入管中。

（2）壳聚糖-BNNTs 跨膜输运阿霉素时，相互作用能结果显示，细胞膜磷脂分子与BNNT (14,14)管存在较强的相互作用，磷脂分子能自发嵌入到BNNT (14,14)管中。管中吸附物质能被细胞膜磷脂分子挤出。这为后续实验设计提供思路，即可以提高管中封装药物浓度，当跨膜输运时，通过磷脂分子挤出药物来进一步提高肿瘤部位给药浓度。