成虫饲料中糖与奶粉不同配比对家蝇繁殖力及卵黄蛋白发生的影响

刘键柏，赵 甜，赵培雅，毛宇翔，颜志波，王方海，李广宏

(中山大学生命科学学院，广州 510275)

家蝇MuscadomesticaL.具有生活周期短，繁殖力强，食物来源丰富和耐高密度养殖等特点(王芳等，2013)。其幼虫(俗称蝇蛆)体内蛋白质含量丰富、氨基酸构成合理，还富含人体及其它动物所需的不饱和脂肪酸、矿物质、维生素等营养物质，此外家蝇体内还含有甲壳素、抗菌肽、凝集素等生物活性物质(李颖和王红育，2009)，是国际上重视和开发利用较早的资源昆虫。我国在20世纪80年代初开始研究家蝇的人工饲养与开发利用，经多年研究，已在人工养殖技术和应用开发上取得了良好进展。但是，在家蝇的大规模饲养中仍存在许多问题，其中成蝇的高效养殖到目前为止也未得到很好解决，以致在生产中，成虫产卵效率仍较低，养殖成本偏高，这在一定程度上制约了家蝇的规模化生产，也阻碍了蝇蛆在饲料行业的推广应用。

与自然种群相比，人工饲养的家蝇产卵力较低，因而,如何提高种蝇的繁殖力就成为了家蝇规模化生产中的关键问题之一(孙刚等，2002)。前人已研究了环境条件(姜晓舜等1993；陈文龙等，1996；纪伟华等，2000；向玉勇和张敏智，2011)、地理种群(陈晓敏等，2009)、成虫营养补充料(黄怀昭等，1982；赛书元等，1991；姜晓舜等，1993；陈文龙等，1996)和种群密度(陈文龙等，1996；纪伟华等，2001；孙刚等，2002)等对成蝇产卵的影响。其中在家蝇成虫饲料方面，多数研究认为以奶粉加糖作为种蝇饲料产卵力最高，但两者的适宜比例是多少，有关此目前尚无报道。鉴于此，本文研究了成虫饲料中糖与奶粉不同配比对家蝇繁殖力及卵黄蛋白合成的影响，旨在为家蝇成虫的高效养殖提供技术支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1供试虫源

家蝇由本实验室提供。

1.1.2主要原料与试剂

某品牌全脂奶粉(市售，蛋白质20%、脂肪24%和乳糖47%)，白砂糖(市售)，麦麸购自南方面粉厂。辣根过氧化物HRP、透析袋、牛血清蛋白(BSA)、羊抗兔酶标二抗、96孔平板(Thermo Scientific)、Protein G Sepharose等购自广州浩玛生物科技有限公司。NaHCO3、Na2CO3、Na2HPO4·12 H2O、NaCL、硫酸铵、NaBH4、NaIO4、HAc均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1家蝇成虫饲料配制

将定量奶粉与白砂糖混合均匀，粉碎，装于塑料袋中，于4℃冰箱保存。7组饲料如下：A1组：100%奶粉+0%糖；A2组：80%奶粉+20%糖；A3组：60%奶粉+40%糖；A4组：50%奶粉+50%糖；A5组：40%奶粉+60%糖；A6组：20%奶粉+80%糖；A7组：0%奶粉+100%糖；

1.2.2成虫饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇繁殖力的影响

选同一天羽化的健康雌、雄成蝇42对，放入直径7 cm、高10 cm玻璃瓶中，每瓶1对，并将42对成虫分为7组，分别饲喂7种不同饲料，重复6次。每日加入定量饲料，更换吸有水的海绵，同时加入含水量为65%～70%的新鲜麦麸，供成虫产卵，记录和测定成虫每日的产卵量、卵孵化率及成虫死亡等情况，统计家蝇成虫单雌产卵量、卵孵化率、雌雄成虫寿命、产卵前期和产卵期，直到实验家蝇成虫死亡。实验条件：温度26℃±1℃；RH 65%±10%；光照L ∶D=12 h ∶12 h。

1.2.3成虫饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇卵黄蛋白合成的影响

1.2.3.1 家蝇卵黄蛋白分离提取

收集家蝇产下的新鲜卵粒，经蒸馏水清洗后用滤纸吸干多余水分，在0.4 mol/L NaCl (0.1% PMSF, 0.02% EDTA)溶液中匀浆(每克卵加10 mL溶液)，1 000 r/min离心30 min，取上清液迅速按1 ∶10的比例加入预冷的双蒸馏水，4℃过夜，使卵黄蛋白沉淀，5 000 r/min离心20 min，取沉淀物再溶于0.4 mol/L NaCl溶液中，经低速离心后取上清液，再按上述比例加入预冷的双蒸水，使卵黄蛋白再次沉淀。依上述方法重复2～3次，即可得到较纯的卵黄蛋白。

1.2.3.2 家蝇卵黄蛋白抗体制备与纯化

将纯化的卵黄蛋白送广州浩玛生物科技有限公司免疫家兔制备抗血清，并经ProteinG琼脂糖凝胶层析纯化抗体。

1.2.3.3 家蝇卵黄蛋白酶标抗体制备

取5 mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于0.5 mL双蒸水中，加入新配制的0.06 mol/L NaIO4水溶液0.5 mL，混匀，置4℃冰箱静置30 min；取出后加入0.06 mol/L乙二醇水溶液0.5 mL，室温放置30 min；加入含5 mg纯化抗体的水溶液1 mL，混匀，并装入透析袋，用0.05 mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液缓慢搅拌透析6 h(或过夜)，使之结合；加入5 mg/L NaBH4溶液0.2 mL，混匀，置4℃冰箱静置2 h；在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃冰箱静置30 min，离心，去上清，沉淀以少许0.02 mol/L pH7.4 PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；次日取出离心，除去不溶物，即得酶-抗体(HRP-IgG)结合物，以0.02 mol/L pH7.4 PBS液加至5 mL；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。

1.2.3.4 间接酶联免疫(ELISA)方法测定

用包被缓冲液将抗原稀释至适合的浓度，每孔中加入100 μL，置于37℃下温育2 h； 倒去孔板中液体，每孔加入100 μL洗涤缓冲液，静止3 min后倒掉，甩干板孔内液体，如此洗板3次。然后每孔加入100 μL的封闭缓冲液，置于37℃下温育1 h，同上洗板3次；再在每孔中加入制备好的100 μL抗家蝇卵黄蛋白酶标抗体，置于37℃下温育1 h，洗板3次；每孔加入TMB底物显色液100 μL，于37℃暗处放置10 min后加入100 μL 1 mol/L H2SO4终止反应，5 min内用Model 680酶标仪在450 nm处测定96孔酶标板每孔的吸光度。

1.2.3.5 样品制备

分别从7种不同饲料饲养的家蝇成虫中，自雌蝇羽化后第一天开始起，连续15 d每天每组取3头雌蝇，冷冻麻醉后用蒸馏水清洗，然后用干净滤纸将虫体表面的水吸干，置于小型研磨器中加入1mL预冷灭菌的昆虫生理盐水(0.75% NaCl, 0.1% PMSF, 亮抑蛋白酶肽Leupeptin 5 μg/mL, 抑蛋白酶肽Aprotinin 1 μg/mL, 0.02% EDTA)进行研磨匀浆，然后吸入Eppendorf管中，5 000 r/min离心20 min，取其上清液体于Eppendorf管中，置于-20℃冰箱备用。

1.3 数据处理

试验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，结果采用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-way-ANOVA)，Duncan’s多重比较法分析试验结果的差异显著性(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 成虫饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇繁殖力的影响

用不同配比的糖和奶粉饲养家蝇成虫，其平均单雌产卵量存在差异，其中以A3产卵最高，为1 935.83粒/雌，而全部用糖饲养的成虫(A7)产卵量最低，平均每雌仅产328.17粒。经方差分析，A3与其余各组差异显著，A2和A4间无差异，但与其余各组均存在显著差异，而A1、A5、A6和A7均差异显著。说明不用奶粉仅用糖饲养家蝇成虫，单雌产卵量明显低于其它各组，但使用蛋白含量过高的饲料饲养，产卵量也会下降。当成蝇饵料中糖的添加比例在20%～60%时，各组雌虫寿命差异不显著，但显著长于用纯奶粉(A1)或糖含量超过80%的处理组，纯奶粉组雌虫寿命又显著长于糖含量超过80%组，其中又以全部用糖饲养的雌虫寿命最短，显著短于其它各组。雄虫随着饵料中糖比例的增加，寿命延长，当糖含量低于50%时，雄虫寿命显著短于糖含量高于50%的处理组。产卵前期各组差异不显著，产卵期以糖含量40%～60%时最长，饵料中糖的比例超出此范围，产卵期显著缩短。卵孵化率随饵料中糖比例的增加而下降，当糖的添加比例超过60%以后，卵孵化率显著降低，其中以全部使用糖的孵化率最低(表1)。经分析比较，初步确定用60%奶粉+40%糖作为家蝇成虫营养补充料饲养效果最佳。

表1 饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇成虫寿命及繁殖力的影响

注:表中数据为6次重复的平均数±标准差。同列数据后不同小写字母表示经Duncan’s新复极差检验在P<0.05水平上差异显著。Notes: Data in table are mean±SD of six replicates. The different small letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 by Duncan’s multiple range test.

2.2 成虫饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇卵黄发生的影响

雌蝇取食含糖量不同的奶粉，其逐日合成的卵黄蛋白及羽化后15 d合成的总卵黄蛋白数量不同(表2)。总的来说，雌蝇取食含糖量越高的饲料，其每日合成的卵黄蛋白及羽化后15 d合成的总卵黄蛋白也越少，尤其是当雌蝇羽化后完全摄取糖而不补充蛋白，其羽化后每日合成的卵黄蛋白均维持在一个比较低的水平，但如果蛋白质补充过多，当奶粉在饲料中的比例达到并超过60%后，雌蝇每日合成的卵黄蛋白及羽化后15 d合成的总卵黄蛋白基本不随饵料中蛋白质的增加而增加。经方差分析，A1、A2和A3组15 d总卵黄蛋的合成量显著高于A4、A5、A6和A7，但它们3组间差异不显著；A4和A5组15 d总卵黄蛋的合成量又显著高于A6和A7，它们之间差异不显著；A6与A7差异显著。从以上实验结果可知，用60%奶粉+40%糖作为家蝇成虫营养补充饲料，其15 d总卵黄蛋白合成量不仅能保持相对高的水平，而且也较为经济。由此从生理的角度进一步证明了用60%奶粉+40%糖饲养雌蝇，其不仅能保持雌蝇良好的繁殖力，同时饲养成本也较低。

表2 饲料中糖和奶粉不同配比对家蝇卵黄发生的影响(μg/雌)

续表2 Continued table 2

日龄(d)AgeA1A2A3A4A5A6A78148.18151.75154.09149.55149.35142.9214.269157.38149.04146.75147.35140.86138.518.1810166.65164.24157.18138.79149.61145.6913.3711171.95157.25140.11141.37141.59140.6611.7912138.78147.95151.86151.29139.39146.723.8413154.81142.42156.17150.16144.99149.862.3614151.83166.66166.76135.70131.66138.790.5815151.55164.64167.32150.19138.61134.690.0215日总卵黄蛋白Total content of vitellin for 15 days1 811.66±6.69 a1 818.77±34.48 a1 806.80±11.01 a1 706.41±20.35 b1 675.08±53.66 b1 607.50±42.01 c132.07±37.19 d

注：表中数据为3次重复的平均数±标准差。同行数据后不同小写字母表示经Duncan’s新复极差检验在P<0.05水平上差异显著。Notes: Data in table are mean±SD of three replicates. The different small letters in the same row indicate significant difference atP<0.05 by Duncan’s multiple range test.

3 结论与讨论

成虫期营养在昆虫生殖行为中具有重要的作用(Boggs，1986)，而家蝇成虫饲料的蛋白含量高低直接影响家蝇成虫的繁殖力。赛书元等(1991)研究发现饲以奶粉为主的饵料，雌蝇产卵量大，而饲以动物粪便和动物内脏，产卵量极小，单饲白糖的成蝇不产卵。陈文龙等(1996)分别用奶粉+蔗糖+水(3种成分用小培养皿分开放置)；奶粉+蔗糖水渍液(分置)；鸡粪水渍液；鸡粪水溃液+蔗糖(分置)；鸽粪水渍液和鸽粪水渍液+蔗糖(分置)6种饲料饲养家蝇成虫，证明用含有奶粉的饲料饲养，成蝇产卵量明显地高于动物粪便或其他试验基质。黄怀昭等(1982)研究表明用含奶粉的饵料饲养家蝇，产卵量远高于用猪、鸡粪作饵料的家蝇成虫。本研究也发现，在家蝇成虫饲料中添加奶粉可提高雌蝇的产卵量。该研究结果与赛书元等(1991)、陈文龙等(1996)及黄怀昭等(1982)的基本一致。但进一步研究发现，当饲料中奶粉添加比例过高或完全使用奶粉，成蝇产卵量反而下降，这与棉铃虫Helithisarmigera(吴坤君等，1993)和甜菜夜蛾Spodopteraexigua(李广宏，1998)成虫对蛋白的需求一致。王争艳等(2010)研究发现家蝇完全取食红糖可正常产卵，因此认为蛋白质不是刺激雌家蝇产卵的必需营养物质，本研究支持了这一观点，但与赛书元等(1991)单饲白糖成蝇不产卵的结果不同，具体原因尚待进一步验证。

本研究发现当成蝇饵料中白糖的添加比例为20%～60%时，雌虫寿命和产卵期均差异不显著，但用纯奶粉或饲料中糖含量超过80%时，雌虫寿命和产卵期显著缩短；雄虫寿命则随着饵料中白糖比例的增加而延长；同时还证明雌蝇产卵前期不受奶粉与白糖配比变化的影响。这与蔗糖可显著提高龟纹瓢虫Propyleajaponica雌虫的体重，在一定程度缩短产卵前期，同时还能显著提高成虫的产卵量的结果不同(张丽莉等，2007)，也与家蝇取食蛋白质能提前雌蝇的产卵期不同(王争艳等，2010)，推测与昆虫种类及提供的蛋白质种类不同有关。

在卵孵化率方面，家蝇卵孵化率随饵料中糖比例的增加而下降，尤其当糖的添加比例超过60%以后，孵化率下降尤为显著。说明家蝇成虫饲料中蛋白质的缺乏，不仅影响成虫的产卵数量，而且也影响卵孵化率。推测可能是由于雌蝇取食含糖量过高的饲料后，导致部分卵发育不完全，使之难以正常孵化。

营养因子是影响昆虫卵黄发生的重要因子，它一方面提供其生命活动所必需的物质基础，另一方面取食活动和食物的刺激是激活内分泌系统的一个信号(龚和和翟启慧，1979)。对家蝇营养研究的结果显示，营养因子对卵黄蛋白合成有较大影响，取食蔗糖或缺蛋白质的饲料不能使其卵巢正常发育，卵子无法形成，而取食蛋白质可以促进卵母细胞发育(Sakauri, 1977; Aguietal., 1985； Adams and Grest, 1991, 1992 a, 1992)。本研究证明雌蝇取食含糖量越高的饲料，其每日合成的卵黄蛋白及羽化后15 d合成的总卵黄蛋白也越少，尤其是当雌蝇羽化后完全摄取糖而不补充蛋白，其每日合成的卵黄蛋白均维持在一个比较低的水平，但如果蛋白质补充过多(如奶粉在饲料中的比例超过60%)，雌蝇每日合成的卵黄蛋白及羽化后15日合成的总卵黄蛋白基本不随饵料中蛋白质的增加而增加，该结果与热孜万等(1997)的一致。

综上可知，成蝇补充充足的蛋白质及适量糖，可以有效提高家蝇生殖力，但蛋白补充过多或过少则会降低成蝇繁殖力。经比较，作者认为以60%奶粉+40%白糖饲养家蝇成虫，其繁殖力最高，成本也较合理。