一株玫烟色虫草对草地贪夜蛾的致病性研究

雷妍圆，吕利华*，王裕华，王德森

(1. 广东省农业科学院植物保护研究所，广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640；2. 华南农业大学农学院，广州 510642)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda，属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一种原产于美洲的农作物害虫，具有寄主植物广、繁殖能力强、迁飞扩散快和为害严重等特点，已在美洲、非洲及亚洲对玉米生产造成了巨大损失(Casmuzeetal., 2010; Earlyetal., 2018; 姜玉英等，2019)。2019年1月首次在我国云南省发现并确认草地贪夜蛾入侵，至目前已在全国21个省份蔓延，危害程度逐日增加(姜玉英等，2019；王磊等，2019；杨普云等，2019)。入侵我国的草地贪夜蛾已确认为玉米品系(张磊等，2019)，主要在幼虫期取食为害。幼虫共有6龄，取食玉米叶片、穗轴、籽粒和钻蛀根基部，影响玉米的产量和品质，严重时导致植株死亡。广东地处亚热带，气候适宜且常年种植玉米，为草地贪夜蛾越冬提供了优越的寄主条件，是草地贪夜蛾的周年繁殖区，防控任务艰巨(郭井菲等，2018；廖永林等，2019)。根据“长短结合、标本兼治”的防治原则(杨普云等，2019)，昆虫病原真菌作为生物防治的一个重要组成部分，在持续控制虫害、保护生态平衡方面具有不可替代的作用(Shah and Pell, 2003; 张礼生和陈红印, 2014)。筛选对草地贪夜蛾高特异性和高效率的生防病原真菌，是我国草地贪夜蛾可持续防控工作的重要任务。

据报道，白僵菌Beauveriaspp.和绿僵菌Metarhiziumanisopliae对草地贪夜蛾卵和低龄幼虫有一定的防治效果(Lezama Gutiérrezetal., 2001; Garcíaetal., 2011; Thomazonietal., 2014)。在利用玫烟色虫草Cordycepsfumosorosea[原玫烟色棒束孢Isariafumosorosea(Kepleretal., 2017) ]防治草地贪夜蛾方面，除了个别研究提到可用于防治低龄幼虫(Lezama Gutiérrezetal., 1996)，其余未见相关研究和报道。玫烟色虫草作为一类国际上研究和应用较为广泛的昆虫病原真菌，能寄生同翅目、鳞翅目、双翅目、鞘翅目和膜翅目等多种有害昆虫(Meyeretal., 2008; 雷妍圆等, 2011; Huetal., 2011; Asietal., 2013)。本研究室曾报道一株高致病力的玫烟色虫草SCAU-IFCF01(吕利华等, 2007)，其对鳞翅目害虫小菜蛾Plutellaxylostlla2龄幼虫的LT50仅1.72 d，LC50为1.17×104孢子/mL，表现出对该类害虫巨大的防控应用潜力。本文研究了该菌株对草地贪夜蛾幼虫的侵染过程及致病力，以明确该菌株对草地贪夜蛾幼虫的致病性、防治时期和防治剂量浓度等参数，为评价玫烟色虫草对草地贪夜蛾的防治潜力，研发相关高效生防制剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源和菌株

草地贪夜蛾幼虫采集于广东省广州市白云区钟落潭镇广东省农业科学院白云基地“粤甜28”甜玉米(ZeamaysL.)植株上，在实验室用玉米叶和果穗饲养至化蛹，待其羽化产卵后建立实验室种群作为供试虫源。室内饲养条件为26℃±1℃，相对湿度60%～90%，光照条件14 L ∶10 D。玫烟色虫草菌株SCAU-IFCF01(雷妍圆等，2010)接种于萨氏培养基SDAY(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母膏10 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 L)平板上，27℃全黑暗条件下培养20 d待用。

1.2 玫烟色虫草对草地贪夜蛾幼虫侵染症状观察

从SDAY平板上收集玫烟色虫草IFCF01分生孢子，以灭菌0.05%吐温-80溶液配制1×109孢子/mL浓度孢子悬浮液，分别接种草地贪夜蛾1～6龄幼虫，每个龄期接种10头，接种后每天观察幼虫存活情况及感染病虫的外部特征，分别于处理后24 h、48 h、72 h、96 h和120 h时依次取样。将死亡幼虫保湿培养，24 h后检查，虫体表面长出白色菌丝或浅玫烟色分生孢子的视为玫烟色虫草感染致死。

1.3 玫烟色虫草对草地贪夜蛾幼虫的致病力测定

采用浸虫法处理草地贪夜蛾幼虫，以灭菌0.05%吐温-80溶液分别配制5个浓度梯度的孢子悬浮液(1×105、1×106、1×107、1×108和1×109孢子/mL)，每个浓度为一个处理，以灭菌0.05%吐温-80溶液为对照。分别选择个体大小、活力一致的1～6龄幼虫，放入供试孢子浓度的悬浮液中，浸渍10 s后挑出，置于滤纸上吸去多余水分，移至皿底垫有湿润滤纸片的培养皿(d=9 cm)中，皿内放入新鲜玉米叶和果穗供其取食，置于人工智能箱中饲养(26±1℃，RH 90%±5%，14 L ∶10 D)。每个处理3个重复，每个重复处理10头幼虫。持续观察5 d，每天记录幼虫的死亡数量，对死亡幼虫进行保湿培养，确定死亡原因。

1.4 数据处理

实验数据经Excel整理后，使用SPSS 20.0软件进行处理分析，统计各处理幼虫的累计死亡率。采用Probit方法计算致死中时(LT50)，求回归方程及计算致死中浓度(LC50)。

2 结果与分析

2.1 感染玫烟色虫草的草地贪夜蛾幼虫症状

草地贪夜蛾1～6龄幼虫均可被IFCF01感染(图1 A-F)。接种后第5天，各龄期幼虫出现玫烟色虫草感染致死个体。感菌的低龄幼虫(1～3龄)体表覆盖菌丝和分生孢子，分生孢子呈浅玫烟色。感菌高龄幼虫(4～6龄)死亡时间相对低龄较晚，虫体表面被白色菌丝包裹。

以4龄幼虫为例，在感菌初期，幼虫取食行为、虫体外部形态与健康幼虫无差别(图2 A)。接种48 h，幼虫取食明显减少或停止取食，部分幼虫濒死，虫体呈油浸状，出现强直症状，体色出现不均匀改变，对触碰反应迟钝。幼虫腹末、胸足基部、腹侧体壁等区域出现菌丝，表明这些部位最易受到菌体侵染(图2 B)。接种72 h，感菌幼虫死亡，虫体略缩短萎缩，除头壳区域外，幼虫大部分体表布满菌丝(图2 C)。接种96 h，幼虫的头部、胸部和腹部均被浓密的白色菌丝所覆盖(图2 D)。接种120 h，幼虫体表的菌丝产孢，虫体被玫烟色分生孢子覆盖(图2 E)。

2.2 玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾幼虫的致病力

用5个浓度玫烟色虫草IFCF01孢子悬浮液处理草地贪夜蛾1～6龄幼虫后，随着孢子浓度增加和时间推移，幼虫累计死亡率逐渐升高(图3)。用1×105孢子/mL 浓度处理幼虫，5 d后1～6龄幼虫的累计死亡率分别为66.7%、54.5%、47.8%、36.7%、22.2%和2.23%。随着浓度的升高，该菌株对各龄幼虫的致死率逐渐升高。当孢子浓度为1×109孢子/mL时，1～3龄幼虫的累计死亡率均达100%，4龄和5龄幼虫也达98.9%和50.0%，6龄幼虫达21.1%。当孢子浓度为1×105和1×106孢子/mL时，4龄、5龄和6龄幼虫死亡率均低于50%，当浓度增加到1×107和1×108孢子/mL时，5龄和6龄幼虫死亡率低于50%，再增加到1×109孢子/mL，6龄幼虫的也低于50%。

应用Probit模型，计算玫烟色虫草IFCF01处理的草地贪夜蛾1龄至5龄幼虫LC50值(表1)，其分别为3.74×104、1.17×105、1.86×105、8.09×105和3.03×108孢子/mL。结果表明致死率50%的浓度，1龄幼虫最低，104孢子/mL，2～4龄均为105，对5龄幼虫的LC50最高，108孢子/mL。上述结果表明，草地贪夜蛾低龄(1～3龄)和4龄幼虫对该菌株较敏感，5龄幼虫其次，6龄幼虫最难受到侵染并致死。

图1 草地贪夜蛾各龄期幼虫感染玫烟色虫草IFCF01的外部症状(第5天)Fig.1 The external symptoms of Spodoptera frugiperda larvae infected by Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 on the 5th day注：A，1龄；B，2龄；C，3龄；D，4龄；E，5龄；F，6龄。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

图2 感染玫烟色虫草IFCF01的草地贪夜蛾4龄幼虫症状Fig.2 The symptoms of 4th instar larvae of Spodoptera frugiperda at the different stage after infection treatment注：A，接种后24 h；B，接种后48 h；C，接种后72 h；D，接种96 h；E，接种后120 h。Note: A, 24 h after inoculation; B, 48 h after inoculation; C, 72 h after inoculation; D, 96 h after inoculation; E, 120 h after inoculation.

图3 玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾幼虫的致病力Fig.3 The pathogenicity of Cordyceps fumosorosea strain IFCF01 against Spodoptera frugiperda larvae注：A，1龄；B，2龄；C，3龄；D，4龄；E，5龄；F，6龄。Note: A, 1st instar; B, 2nd instar; C, 3rd instar; D, 4th instar; E, 5th instar; F, 6th instar.

表1 玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾幼虫的致病力回归方程

注：表中数据为平均值±标准差；“-”表示草地贪夜蛾幼虫的最终死亡率低于50%，无法估算LC50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-” represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LC50values cannot be estimated.

2.3 玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾幼虫的致死时间效应

随玫烟色虫草IFCF01孢子悬浮液浓度的增加，草地贪夜蛾幼虫的致死中时(LT50)缩短(表2)。孢子浓度越高，幼虫的LT50值越小，在1.0×105～1.0×109孢子/mL范围内，1龄幼虫LT50从3.62 d降至1.37 d，对2龄幼虫的LT50从4.51 d降至1.65 d；在浓度为1.0×106～1.0×109孢子/mL的范围内，对3龄幼虫的LT50从4.03 d降至1.82 d；在浓度为1.0×107～1.0×109孢子/mL范围内，对4龄幼虫的LT50从3.47 d降至2.52 d；浓度为1.0×109孢子/mL时，5龄幼虫的LT50为4.74 d。当浓度为1.0×105和1.0×109孢子/mL时，3龄和6龄幼虫的最终死亡率分别为47.8%和21.1%，均低于50%；1.0×105和1.0×106孢子/mL时，4龄幼虫的最终死亡率从36.7%升至43.3%；浓度为1.0×105～1.0×108孢子/mL时，5龄和6龄幼虫的最终死亡率分别从22.2%升至48.9%和2.23%升至16.7%，均低于50%，因此无LT50值。

表2 玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾幼虫的致死中时间

注：表中数据为平均值±标准差；“-”表示草地贪夜蛾幼虫的最终死亡率低于50%，无法估算LT50。
Note: Data in a column are presented as Mean±S.D.; “-”represent that the mortality of infected larvae was less than 50%, LT50values cannot be estimated.

3 结论与讨论

寄主昆虫的表皮是抵御病原真菌侵染的第一道屏障(Buttetal., 1995)，分生孢子在表皮的附着速度是影响菌株致病力的一个重要因素。玫烟色虫草分生孢子在寄主表皮上附着能力越强，其致病力也越强(Altreetal., 1999; Altre and Vandenberg, 2001)。本研究中的供试玫烟色虫草IFCF01接种于草地贪夜蛾4龄幼虫，分生孢子能够从腹末、胸足基部、腹侧体壁等区域附着和萌发进入体内，且在后期可在幼虫较坚硬的头壳成功侵入和菌丝生长，说明菌株IFCF01对草地贪夜蛾幼虫具有较好的附着和侵染能力。玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾1龄至6龄幼虫均有侵染效果，但龄期间的致病力差异较大，低龄幼虫对玫烟色虫草的敏感性高于高龄幼虫，尤其是1龄幼虫易受感染且致死时间短。在较适温度下，草地贪夜蛾幼虫生长发育迅速，尤其是低龄幼虫的历期更短，仅1～2 d，蜕皮快，因此真菌孢子容易随幼虫蜕皮而被剥离体表，但试验中供试菌侏对低龄幼虫仍有极高致病力，这可能与该菌株快速的入侵能力有关。与低龄幼虫相比，高龄幼虫的历期较长，为孢子侵染提供了更充足的时间，然而本试验中高浓度孢子悬浮液却对6龄幼虫的致死率仅21.1%(1.0×109孢子/mL)，推测这可能与高龄幼虫的体壁结构和免疫能力有关，即鳞翅目昆虫的低龄幼虫体壁较薄，真菌孢子更易穿透并完成侵染，而高龄幼虫体壁蜡质层增厚，表皮硬化加强、幼虫免疫和代谢能力增强而更具抗病性(蒲蛰龙和李增智, 1996; Meyeretal., 2008)。

昆虫病原真菌致病力是筛选高效菌株的主要依据之一，也是衡量其防效潜力的重要指标之一。死亡率越高且LT50越短，意味着病原真菌具有更好的致病力。据报道，用35株球孢白僵菌Beauveriabassiana菌株和14株金龟子绿僵菌Metarhiziumanisopliae对草地贪夜蛾进行致病力筛选，仅有1株球孢白僵菌菌株Unioeste 26可导致草地贪夜蛾3龄幼虫44.5%死亡率(Thomazonietal., 2014)。此外，另有报道1株球孢白僵菌菌株Bb 42对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC50为5.92×103孢子/mL，且1.0×109孢子/mL时，其2龄幼虫死亡率达96.6%，致死中时LT50为3.6 d(Garcíaetal., 2011)。本研究表明，对于龄期相同的2龄幼虫，供试玫烟色虫草IFCF01的LC50为1.17×105孢子/mL，略高于前者的5.92×103孢子/mL；当处理孢子悬浮液也为1.0×109孢子/mL，1～3龄幼虫的累计死亡率均达100%，而且4龄幼虫的也达98.9%，较白僵菌的致病力强；再以 2龄幼虫LT50值比较，本研究的仅为1.65 d，较前者的致死速度快。分析表明，本研究中供试玫烟色虫草菌株具有较强的致病力。

本研究中的菌株IFCF01对高龄幼虫的LC50远大于低龄幼虫的LC50，在同一孢子浓度下对低龄幼虫的致病力大于高龄幼虫，尤其对草地贪夜蛾 4龄以下的幼虫侵染效果最好，因此利用玫烟色虫草防治草地贪夜蛾幼虫的适期是低龄幼虫种群的高峰期。由于草地贪夜蛾对昆虫病原真菌的敏感性随地理种群不同而产生变化(Lezama Gutiérrezetal., 2001)，因此菌株的致病力还可能与试虫地理种群、菌株本身生物学特性以及实验环境因素有关。本研究中的玫烟色虫草IFCF01对草地贪夜蛾低龄幼虫具有较强的致病力，具有较高的研究价值和市场潜力，但如何发挥该株玫烟色虫草在草地贪夜蛾可持续防控中的作用仍需进一步研究。