库蠓亚属6种库蠓翅形变化分析及亲缘关系探讨

甯 媛，段 琛，常琼琼，侯晓晖

(遵义医科大学基础医学院，贵州遵义 563000)

吸血蠓(Blood-sucking midges)是一类可刺吸动物血液的蠓科昆虫，其中部分种类还可传播虫媒病原体带来极大的危害。全世界蠓科昆虫中仅有4属蠓类属吸血蠓，即库蠓属Culicoides、蠛蠓属Lasiohelea、细蠓属Leptoconops和澳蠓属Austroconops，共1 671种(Borkent，2016)，中国仅分布3属(澳蠓属除外)共443种(常琼琼等，2017)。库蠓属Culicoides是蠓科Ceratopogonidae中最大的一个属，其中很多种类可吸食人畜血液并传播人畜疾病，是一类重要的媒介昆虫(Kaliontzopoulouetal., 2007; Hoffmannetal., 2009; 王飞鹏等，2010；张海林等，2012；Carpenteretal., 2013)。迄今为止，由媒介蠓虫传播的蓝舌病多次在欧洲等地爆发流行，带来巨大的经济损失，媒介蠓虫也因此成为近年来国内外研究的热点。由于库蠓体型微小、种类繁多，传统分类方法在实际工作中存在诸多困难，故需要开发更多的新技术、新方法实现蠓虫快速、准确的分类鉴定。

几何形态学是基于笛卡尔坐标对形状特征进行定量描述和分析的统计分析方法，能准确直观地解释不同生物体种内与种间微小的形状差异(Kaliontzopoulouetal., 2007)。有学者发现昆虫的翅不仅容易测量，而且不易发生形变，认为其特别适合进行生物测量学研究(Dujardinetal., 2003)。因此，几何形态学已被应用于包括蠓科昆虫在内的诸多昆虫类群的分类研究(Gurgel-Gonçalvesetal., 2011; Muoz-Muozetal., 2011, 2014, 2016; Deblauweetal., 2012; Fernández-Montravetaetal., 2017)。本研究以库蠓亚属中 6个近似种(渐灰库蠓Culicoidesgrisescens、光胸库蠓Culicoidesimpunctatus、日本库蠓Culicoidesnipponensis、灰黑库蠓Culicoidespulicaris、刺螫库蠓Culicoidespunctatus、天祥库蠓Culicoidestienhsiangensis)为研究对象，运用地标点法定量对库蠓翅的形态变化规律进行分析，以期对库蠓近似种进行准确的分类鉴定和亲缘关系分析。

1 材料与方法

1.1 材料

研究选取翅面完整无褶皱的6种库蠓标本共24张，将所有样本进行编号，相关信息见表1。

表1 本研究所用标本信息

1.2 图片采集及标准化处理

首先，将玻片置于装有Canon DS 126371照相机的Leica DM2500显微镜上，采集翅图像，并保存图片为JPG格式。然后，使用TPSdig 2软件对每种库蠓的翅选择翅脉稳定的交叉点或转折点进行数字化标点(Landmark)，共标记12个点(图1)，所得数据输出为TPS文件。再使用tpsSmall软件对形态原始数据集内部相关性进行检验，并使用广义普氏分析法(Generalized procrustes analysis, GPA)将地标点轮廓叠加，并使地标点离差最小化，在同一坐标体系中剔除形态信息分析中非形态因素的影响。

图1 翅的12个地标点及翅脉(以渐灰库蠓Culicoides grisescens为例)Fig.1 Distribution of twelve landmarks and veins on wing of Culicoides grisescens注：Arc, 弓脉; M, 中脉; R, 径脉; R-M, 径中横脉; Cu, 肘脉; r1,径1室; r2,径2室。Note: Arc, Arculus; M, Medial; R, Radial; R-M, Radial-median crossvein; Cu, Cubital; r1, First radia; r2, Second radia.

1.3 翅形变化分析

使用Morpho J软件，利用主成分分析(Principal component analysis, PCA)和典型变量分析(Canonical variate analysis, CVA)方法，对蠓虫翅的几何形态学数据进行分析。在PCA的基础上，进行了CVA，相关结果以马氏距离(Mahalanobis distance)来展现，并运用tps-Super 32软件计算种内平均形态，tps-Small 1.20软件计算样本间普氏距离，通过NTsys 2.10e软件运用非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means, UPGMA)分析普氏距离矩阵，创建表型树对库蠓亚属6种库蠓的数据进行聚类分析，进而探讨种间亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 翅的形态变异

使用Morpho J对6种库蠓进行CVA分析，获得种间翅形变化情况。由CVA散点图(图2)可知，同一种库蠓很好的聚在一起，不同库蠓之间距离相隔甚远并无交叉。同时，通过种间马氏距离及其P值比较表(表2)可知，6种库蠓的翅有显著差异，具有统计学意义(P﹤0.05)，其中天祥库蠓和日本库蠓的马氏距离最大(49.7521)，表明6种库蠓中两者的翅形变化最大，而光胸库蠓和渐灰库蠓的马氏距离最小(8.7819)，表明6种库蠓中两者的翅形变化最小。

图2 6种库蠓翅形状典型变量分析散点图Fig.2 Scatter plots of Canonical variate analysis of six Culicoides

2.2 聚类分析

利用获得的6种库蠓翅形态变化平均数据计算种间翅形的普氏距离，然后根据普氏距离矩阵进行聚类分析建立近似种间表型树，比较6种库蠓间的亲缘关系。由图3可知，该表型树中日本库蠓首先与其余5种库蠓分开，之后刺螫库蠓、天祥库蠓以及灰黑库蠓先后从5种库蠓的大支中分出，而光胸库蠓和渐灰库蠓则聚为1支。因此，在上述6种间日本库蠓与其余5种的亲缘关系最远，而光胸库蠓和渐灰库蠓的亲缘关系最近。

表2 6种库蠓翅间马氏距离及其显著性比较表(基于10 000次重复)

图3 基于普氏距离对6种库蠓的聚类分析Fig.3 Phenetic tree of the studied populations of six Culicoides wing based on the Procrustes distance

3 讨论与结论

吸血蠓作为一类具有重要经济意义的媒介昆虫，由于其体型微小、形态相似，较难区分，并且实际工作中尚存在标本残缺或者数量不足的情况，甚至还可能受鉴定者的经验、主观因素等影响，导致应用传统分类方法在实际鉴定过程中有一定难度，这些都给疾病防控和检验检疫工作带来了极大的困难。几何形态学克服了传统形态差异描述中的单一变量比较的缺陷，通过计算不同标点间的距离，借助一系列统计方法将形态上的变异客观、准确地呈现出来，而且还可以通过比较样本间的普氏距离展示出种间亲缘关系，在一定程度上弥补了传统分类鉴定的不足。

由于翅的大小并不能作为种属区分的依据(Birdsalletal., 2010; 段琛等，2018)，故本研究利用几何形学方法对库蠓亚属6种库蠓进行了翅的形态比较及聚类分析，发现上述种类在翅形和翅脉上的微小变化，进一步将不同种类的库蠓准确区分，这与国外学者利用几何形态学在库蠓以及按蚊、实蝇等方面获得的研究成果一致(Suetal., 2015; Giordanietal., 2017; Gómezetal., 2017; 李玲等，2017)。此外，聚类分析可初步用于种间亲缘关系判定，如本研究6种库蠓中日本库蠓与其余5种库蠓的亲缘关系最远，光胸库蠓和渐灰库蠓的亲缘关系最近。因此，翅的几何形态学能够初步用于探讨种间亲缘关系，但由于自然界中存在普遍的协同进化现象，其揭示的可能只是不同研究对象表型上的近似或差异，其结果能否准确地反应物种之间的系统发育关系还需结合生物学、生态学、分子等多种数据进行综合分析。

几何形态学具有成本低、速度快、可重复性强、输出结果直观等优点，对于无法使用分子手段进行检测的老标本或者蠓类这种制成玻片保存的标本，该方法尤为适用。但是，任何方法都有其局限性，几何形态学亦是如此，其可能存在人为误差、选取特征片面、残缺标本无法检测等。因此，在以后的研究中需要进一步的探究以及开发更为合理有效的计算机运行技术，使得该门技术更加科学、有效、直观，在昆虫学乃至其他学科的研究中发挥更大的应用价值。