徐 桢,陈 云,卫恒习,李 莉,孟 立,张守全
(华南农业大学动物科学学院,国家生猪种业工程技术研究中心,广东省农业动物基因组学与分子育种重点实验室,广东广州 510642)
随着规模化养猪业的快速发展及种公猪站越来越广泛地推广应用,种公猪精液的品质对养猪企业经济效益的影响越来越显著。种公猪射精量少、精子畸形率高、活力弱等不良精液品质表现是导致种公猪繁殖障碍的重要因素。有研究称,RUVBL2(RuvB-like 2)蛋白在人体睾丸组织中的表达水平远高于其他组织,这反映了在精子生成和成熟的过程中RUVBL2基因可能发挥着重要作用[1]。RUVBL2 蛋白与多种细胞的活性相关,并参与了多种细胞活动的过程,包括染色质重塑和基因表达的调节等[2]。有研究证明,RuvB-like 蛋白在复合物的组装中起着重要作用,具有分子伴侣的活性[3]。此外,RUVBL2基因特异性地存在于成年小鼠的睾丸和睾丸生精细胞的细胞质和细胞核中,这可能与小鼠精子的成熟或生殖细胞的分化过程相关[4]。但RUVBL2基因在种公猪的精子生成或成熟过程中的作用机理尚不清楚。本研究旨在构建猪的pIRES2-EGFP-RUVBL2 真核表达载体,并将其转染到CHO 细胞中,进一步观察猪睾丸组织中的RUVBL2基因能否在CHO 细胞中表达,为研究RUVBL2基因在种公猪精子生成和成熟过程中的作用机理奠定基础。
1.1 实验材料 3 头15 月龄长白种公猪的睾丸组织、pIRES2-EGFP 质粒和CHO 细胞为本实验室所保存;无内毒素质粒DNA 小量提取试剂盒、凝胶DNA 微量回收试剂盒、细胞RNA 提取试剂盒、DH5α感受态细胞、化学发光液购自Tiangen 公司;全蛋白提取试剂盒、BAC 蛋白含量检测试剂盒购自凯基生物技术股份有限公司;SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;DL2000 DNA Marker、DL 15000 DNA Marker、限制性内切酶、T4 连接酶购自TaKaRa 公司;脂质体转染试剂购自Gibco 公司;兔源RUVB2 抗体(bs-19836R)购自Bioss 公司;鼠源β-actin抗体(T0022)购自Affinity 公司;HRP 标记山羊抗鼠IgG(E030110)、HRP 标记山羊抗兔IgG(E030120)购自Earthox 公司;DMEM、胎牛血清购自Sigma 公司;Western-blot Marker(180 ku)购自Fermentas 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank 数据库中RUVBL2基因全长序列(NM_001243867.1),用Primer 5.0 软件设计引物,上游引物:5'-CGGAATTCATGA CAACCGTGACAGCCA-3'(下划线为EcoRI 酶切位点);下游引物:5'-AACTGCAGGGAGGTGTCCAT GGTCTCG-3'(下划线为PstI 酶切位点),预计PCR产物长度为1 392 bp。引物由广州艾基生物技术有限公司合成。
1.2.2 目的基因的扩增 分别以3 头长白种公猪睾丸组织cDNA 为模板,进行目的基因扩增。PCR 反应体系(50 μL):2× PCR Mix 酶25 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL,模板(2.5 ng/μL)2 μL,ddH2O 19 μL。PCR 反应程序:94℃ 预变性3 min、94℃变性30 s、62℃ 退火30 s、72℃ 延伸90 s 35 个循环、72℃彻底延伸10 min。随后用1%琼脂糖凝胶电泳进行扩增产物的鉴定及目的基因片段回收。
1.2.3 重组质粒的构建与鉴定 将质粒pIRES2-EGFP和胶回收的PCR 产物分别用EcoRI 酶和PstI 酶进行双酶切;之后进行16℃ 16 h 目的基因RUVBL2的片段连接,反应体系(15 μL):DNA 片段(45 ng/μL)9.5 μL、载体质粒pIRES2-EGFP(50 ng/μL)3.2 μL、10×Buffer 1.5 μL、T4 DNA 连 接 酶0.8 μL;最 后 将 连接产物转化至DH5α感受态细胞,涂板,37℃过夜培养,再挑选克隆抽提质粒,用双酶切法进行阳性克隆鉴定并送至生工生物工程股份有限公司(上海)测序。
1.2.4 脂质体法转染CHO 细胞 在转染前一天用0.25%的胰酶消化CHO 细胞并计数,24 孔铺板时细胞密度为1×105个/mL,按照脂质体转染试剂Lipo3000 的说明书将重组质粒转染至CHO 细胞中。转染24~48 h 后,用荧光显微镜观察转染后的表达情况。
1.2.5 转基因细胞的RT-PCR 使用RNA 提取试剂盒从转染48 h 的贴壁细胞中提取RNA。反转录CHO 细胞的cDNA,第一步反应体系(10 μL):Oligo dT Primer(50 μmol/L)1 μL、dNTP Mix 酶1 μL、模 板RNA(50 ng/μL)5 μL、RNase Free ddH2O 3 μL,65 ℃5 min、冰上迅速冷却;第二步反应体系(20 μL):上步反应液10 μL、5× PrimeScript II Buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、PrimeScript II RTase 1 μL、RNase Free ddH2O 4.5 μL,42 ℃ 30~60 min、95 ℃ 5 min。CHO 细 胞cDNA 的 RTPCR 反应体系(10 μL):2× Tap Plus Master Mix 酶5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,CHO 细胞cDNA(10 ng/μL)1 μL,ddH2O 3 μL,94 ℃预变性5 min、94℃ 变性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min 32 个循环、72℃ 彻底延伸7 min 。反应完成后,进行1%琼脂糖凝胶电泳的检测。
1.2.6 转基因细胞的Western-blot 检验 将贴壁细胞从壁上刮下来,并转移至离心管中,室温下2 000 r/min离心10 min,去除滤液,再用PBS 洗细胞,相同条件下再离心5 min,后再重悬细胞,再次离心5 min,之后使用全蛋白试剂盒提取培养细胞中的蛋白质,并用BAC 蛋白含量检测试剂盒测定蛋白浓度。将提取纯化的CHO 细胞蛋白经SDS-PAGE 电泳后,转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,经5% 脱脂奶粉的封闭,之后分别进行一抗兔源RUVB2(1:1 000 稀释)和一抗鼠源β-actin(1:1 000 稀释)的孵育(摇床上孵育1 h 或者4℃条件下孵育过夜),孵育完成后先后进行10 min/次TBST(2 次)和10 min/次TBS(1 次)的洗膜。洗完膜后,用同样的方法分别进行HRP 标记山羊抗鼠二抗(1:4 000 稀释)和HRP 标记山羊抗兔二抗(1:4 000 稀释)的孵育及二次洗膜,随后在曝光仪下进行曝光反应。
2.1RUVBL2基因的扩增与鉴定 分别以3 头长白种公猪睾丸组织cDNA 为模板,使用上述引物扩增出睾丸RUVBL2目的基因,经琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图1 所示,扩增片段大小约1 392 bp,与预计片段长度相符。
2.2 重组表达载体的PCR 鉴定与双酶切鉴定 同样用上述引物进行重组质粒的PCR 鉴定以筛选出阳性克隆质粒,经琼脂糖凝胶电泳检测显示其大小约1 392 bp(图2-A),后利用限制性内切酶EcoRI 和PstI 对阳性克隆质粒进行双酶切鉴定,其结果(图2-B)与预期结果相符。
2.3 重组表达载体的测序鉴定 将重组表达载体送至生工生物工程股份有限公司(上海)进行测序鉴定,结果证明RUVBL2基因已正确地插入到了载体pIRES2-EGFP 的多克隆位点,三联密码阅读框正确。RUVBL2基因序列使用Blast 分析,结果与原序列吻合度为100%。
2.4 转基因细胞RUVBL2 融合蛋白的荧光鉴定 将构建成功的pIRES2-EGFP-RUVBL2重组表达载体转染到CHO 细胞后,恒温培养24 h 后观察荧光结果(图3),表明pIRES2-EGFP-RUVBL2重组表达载体已成功转染到了CHO 细胞中。
2.5 转基因细胞的RT-PCR 鉴定 以转染了重组表达载体CHO 细胞的cDNA 为模板进行PCR 扩增反应,再用PCR 扩增产物进行β-actin 作为内参的琼脂糖凝胶电泳,其结果与预期相符(图4)。
2.6 转基因细胞的Western-blot 鉴定 以未转染重组表达载体的CHO 细胞为对照、β-actin 为内参进行Western-blot 鉴定,转染过重组表达载体pIRES2-EGFP-RUVBL2 的CHO 细胞中有一种相对分子量约为26 ku 的蛋白,其大小与GFP 蛋白大小相一致(图6)。
RUVBL2 蛋白是细菌DNA 解旋酶RUVB 蛋白在哺乳动物中的同源蛋白[5]。RUVBL2基因在调节能量代谢、DNA 修复、转录、细胞周期调控、应激适应和疾病等过程起着重要作用[6-8]。有研究表明,小鼠早期胚胎的致死与RUVBL1基因和RUVBL2基因有关,并且RUVBL1基因和RUVBL2基因在小鼠早期胚胎发育开始时起着关键作用[9]。同时有研究发现小鼠睾丸中RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白对体内蛋白稳定性方面具有独特的相互依赖作用[10]。另有报道,RuvB-like 1 蛋白、RUVBL2 蛋白与Hsp90 可形成R2TP(Ruvbl1-RUVBL2-Tah1-Pih1)复合物,并且可作为共同伴侣参与多种蛋白复合物的组装[11]。韩潆仪[12]通过脂质体转染法将RUVBL2 siRNA 转入到人肺纤维细胞,并发现RUVBL2基因的缺失或表达抑制将会阻碍DNA 损伤修复的应答进程。郑英等[5]构建了人RUVBL2真核表达载体,并使其能够在HeLa 细胞中表达。本研究发现,长白种公猪的睾丸组织中特异性地存在着RUVBL2基因,这可能与公猪的生殖细胞分化过程有关,RUVBL2基因可能在其中参与DNA 复制、重组等过程。然而,目前国内外对RUVBL基因的研究多来自于鼠源和人源,并未发现有猪源RUVBL2基因的相关研究报道。本研究发现并构建了猪源RUVBL2真核表达载体pIRES2-EGFP-RUVBL2,并成功地转入到了CHO 细胞,这一实验结果证实了种公猪睾丸组织中的RUVBL2基因能够在CHO 细胞中表达,对种公猪睾丸组织中RUVBL2基因在体外异源细胞中的表达有了新的认识,为种公猪体外研究RUVBL2基因对种公猪精子生成和成熟过程中的作用机理奠定了理论基础。
本实验从猪的睾丸组织中克隆出了RUVBL2基因,并构建了猪的RUVBL2真核表达载体pIRES2-EGFPRUVBL2,同时借助脂质体将重组表达载体成功地转入到了CHO 细胞,证实了猪睾丸组织中的RUVBL2基因能够在CHO 细胞中表达。