猪卵母细胞 GV/MII 期 mRNA/lncRNA差异表达的研究

焦亚飞，刘树林，叶 升，高邦君，石德顺，黄 奔

（广西大学动物科学技术学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西南宁 530004）

猪卵母细胞的成熟质量对其体外受精（IVF）、核移植（NT）和孤雌激活（PA）后的胚胎发育有重要影响，但体外成熟卵母细胞质量远低于体内成熟的卵母细胞。与体内成熟的卵母细胞相比，体外成熟的卵母细胞存在多精受精率高、囊胚发育比率低、核质成熟不同步等问题，随着技术条件及生产实际条件的提高，需要对卵母细胞成熟的机理进行更深入的研究。通过高通量测序技术探究卵母细胞成熟过程中基因表达情况已逐渐在生物学研究领域广泛应用。在人的基因组文库研究中通过高通量测序技术已经揭示了人类基因组文库并且在其中发现大量非编码基因[1]。非编码RNA 根据长度可以分为小RNA 和lncRNA。通过高通量测序技术对人卵巢颗粒细胞的研究中发现，RNA 在调控细胞转录信号通路中发挥更重要的作用[2]。但目前与猪卵母细胞成熟有关的lncRNA 的相关研究却鲜有报道。因此，本研究旨在揭示猪卵母细胞体外成熟过程中lncRNA 的表达变化情况，筛选与卵母细胞体外成熟相关比较密切的关键lncRNA。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 激素：孕马血清素（PMSG）为上海市计划生育研究所生产，人绒毛膜促性腺激素（HCG）为Sigma 公司产品。血清：胎牛血清（FBS）为Hyclone公司产品。细胞裂解液：cells-to-cDNA™II Kit 来自Ambion 公司。TCM199：Medium 199 来自 Gibco 公司。如无特殊说明，其他药品均来自Sigma 公司。

1.2 GV 期与MII 期卵母细胞的获得 从南宁当地屠宰场收集猪卵巢，去除表面不相关系膜等组织，用装有33℃生理盐水的保温壶3 h 内运到实验室，先用75%酒精快速洗1 次（10 s 内），然后用37℃的生理盐水洗3 遍，挑取直径为3～8 mm 的卵泡，用带有12 号针头的10 mL 注射器抽卵泡液及细胞，放入10 mL 玻璃试管中，在39℃恒温加热器上静置15 min 后用CCM 洗液稀释分装到60 mm 玻璃皿内，在倒置显微镜下选取3 600 个左右卵丘卵母细胞复合体（卵丘细胞3 层以上），用0.1%透明质酸酶消化掉卵丘细胞，然后挑取细胞状态良好且卵周隙清晰的卵母细胞，用PBS（不含青霉素、链霉素）清洗3 遍后放入装有Trizol 的EP 管中，-80℃保存；另一部分（3 600 个左右）放入成熟液中继续培养42～44 h，前22 h 用含有激素的PM 液培养，后22 h 用不含激素的PM 液培养，培养条件为38.5℃、5%CO2、最大饱和湿度培养，到MII 期用0.1% 透明质酸酶消化卵丘细胞，用PBS（不含青霉素、链霉素）清洗3 遍，选取质量好的卵母细胞放入装有Trizol 的EP 管中，-80℃保存。

1.4 猪GV 期与MII 期卵母细胞mRNA/lncRNA 文库的构建及测序 对猪卵母细胞GV 与 MII 时期每个样品分别取3 μg 作为起始量构建mRNA/lncRNA 文库。采用Ribo-Zero™GoldKits 技术去除样品中的rRNA，根据NEB Next Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，Ispawich，USA）的操作步骤，将不同的index 进行分别标签建库。

1.5 微量样品的反转录和QRT-PCR 将收集得到的GV与MII 期卵母细胞用PBS/PVA 清洗3 遍，去除血清等物质，尽量少带液体，每组5 个转移至含有8 μL 细胞裂解液的离心管中，并放于-80℃冰箱中保存（不超过3 d），立即对样品进行反转录和实时荧光定量PCR。

猪卵母细胞荧光定量PCR 实验中引物序列mRNA见表1，lncRNA（表2）序列以GAPDH 基因为内参。

1.6 GO 分析 Gene Ontology（简称 GO）是一个提供Controlled Vocablary 对生物体内基因和产物属性全面描述的国际标准化的基因功能分类体系。通过对所有的样本进行GO 富集，并根据样本富集显著的GO 值绘制分布图，计算得到的p-value 通过校正之后，以q＜0.05为阈值，满足此条件的GO 条目定义为在差异表达基因中显著富集的GO 条目。通过GO 功能显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。

1.7 KEGG 分析 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）是一个集合了基因组、化学等系统功能信息对基因组进行处理的数据库。通过超几何检验对KEGG中各通路进行富集分析，发现差异基因显著富集的信号通路，并进一步研究。

2 结果

2.1 序列质量处理 猪卵母细胞GV 期共获得101 478 488条序列总数（raw reads），猪卵母细胞MII 期文库测序获得97 431 276 条序列总数。经过一系列质量控制程序，去掉低质量的序列，GV 期获得99 924 810 条高质量序列，MII 期获得96 152 164 条高质量序列，分别占序列总数的98.47%和98.69%。

表1 mRNA 引物序列

表2 lncRNA 引物序列

2.2 测序质量分布 根据 clean reads 对碱基质量进行作图，碱基测序质量主要分布在Q40 左右，说明测序质量分布良好有利于后续生物学析。

2.3 差异基因（mRNA）分析 采用DEseq 进行差异基因的表达分析，以|log2Ratio|≥1和 q＜0.05 为条件作为显著差异表达筛选基因，通过筛选得到差异基因个数，并根据测得数据与猪参考基因组相对比，共分析出18 060 个已知mRNA，其中2 486 个特异性表达基因，752 个上调基因，1 734 个下调基因。通过比较MII 与GV 期数据，利用R 软件（版本号：v3.1.1）对不同样本进行差异基因聚类分析（图1），结果显示MII 与GV 期之间基因差异表达有较大差异。同时通过差异基因火山图（图2），在2 个样本上差异基因总体表现为下调表达。

2.4 测序结果QRT-PCR 随机选择了10 个mRNA 的转录本进行引物设计，并在获得引物之 后进行QRTPCR 验证测序结果的可靠性。如图3 所示，EIF3、GTF2F1、SHD、OOEP、RPL22、RPS15等 6 个基因显著下调，KLF1C、MAP1B显著上调，RPUSD4、RPL22差异不显著。以上结果与RNA-seq 测序结果基本相符合，表明本研究获得的mRNA 转录本文库精准可靠，能真实反映猪卵母细胞成熟过程中基因表达的差异，可用于后续的实验分析。

2.5 差异基因的GO 功能分析及KEGG 分析 对GO 富集功能团富集情况的研究发现：共富集在生物进程功能团共12 360 个，差异基因富集细胞组成功能团1 567 个，差异基因富集分子功能功能团3 721个。从聚集基因数量、富集功能团差异性进行分类，共分为3 种功能团：参与生物进程功能团有24 个，3 351 个差异基因，1 143 个基因上调，2 208 个基因下调；细胞组成功能团22 个，264 个基因上调，346 个基因下调；分子功能功能团19 个，192 个基因上调，216 个基因下调（图4）。

差异基因的KEGG 分析结果表明，与GV 期相比，MII 期共富集信号通路272 个，但只有核糖体信号通路显著性富集，差异基因在卵母细胞成熟前后富集的信号通路还有糖酵解信号通路、三羧酸循环、半乳糖代谢、脂肪酸生长代谢、类固醇物质合成等相关信号通路及代谢方式上也有富集。为了对比筛选出猪MII 与GV期特异性表达的基因，对差异基因排名前30 的基因进行统计，查找相应的信号通路发现差异基因AGXT2、SULT2B1、RPS26分别在PPAR 信号通路、氧化磷酸化以及核糖体等与卵母细胞成熟相关的信号通路上富集。

2.6 lncRNA 表达分析 通过比较MII 与GV 期数据，对不同样本进行lncRNA 聚类分析的结果显示（图5），MII 与GV 期之间lncRNA 有较大差异。对比样品组织lncRNA 信息熵（JS＞0.5）和表达情况（图6）以及表达量热图分析结果发现，lncRNA 在GV 期的组织特异性更强（图7）。通过CNCI 分析、CPC 分析、PFAM蛋白结构域分析、CPAT 分析结果采用韦恩图的形式展示（图8），结果显示共筛选出lncRNA 22 811 个，其中差异lncRNA 9 868 个，已知差异lncRNA 15 个。

2.7 lncRNA QRT-PCR 的验证 在差异lncRNA 文库中随机挑选12 个lncRNA 进行引物设计，QRT-PCR 实验验证获取转录本的可靠性，结果显示MSTRG.45076、MSTRG.20286、MSTRG.43090、MSTRG.10273、MSTRG.31755、MSTRG.29273、MSTRG.48199、MSTRG.18967在卵母细胞中显著下调，MSTRG.20361显著上调，MSTRG.1631、MSTRG.49224、MSTRG.24487差异不显著（图9）。以上结果基本与高通量测序结果保持一致，说明本研究获得的lncRNA 转录结果可靠准确，能够真实反映猪卵母细胞成熟过程中lncRNA 表达的差异性。

2.8 差异lncRNA 靶基因及对应的信号通路分析 差异lncRNA 靶基因的功能富集分析显示，差异lncRNA靶基因共富集有17 966 个功能团，其中富集在生物进程 中的靶基因12 581 个、细胞组成1 578 个、分子组成3 807 个。对所有GO 功能团进行无环图分析，得到lncRNA 靶基因富集功能团富集前5 的功能团，这些功能团主要参与调控细胞状态，调控细胞周期，调控基因的表达、分子结构活性、细胞生物过程以及有机环化物的结合。lncRNA 靶基因的KEGG 分析结果表明，MII与GV 期共富集了272 个信号通路。对差异lncRNA 对应靶基因的KEGG 信号通路进行统计，发现富集的信号通路有三羧酸循环、嘌呤代谢、谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、半乳糖代谢，同时也包括抗坏血酸盐等与疾病相关的信号通路。

3 讨 论

3.1 转录组测序结果分析 在卵母细胞成熟过程中，核质成熟的不同步化是制约体外卵母细胞发育的重要因素。转录组 测 序 分 析SFRP4、PGR、PGRMC1、PLCZ1、ZMIZ1等基因在卵母细胞细胞核的转录过程、激素的分泌、卵丘细胞的扩展以及卵母细胞减数分裂进程中起到重要作用，这一结果与前人研究相似[4-7]；同时也发现在卵母细胞成熟过程中RNA 转录酶II 的关键基因ZSCAN4111，调控原始卵泡发育的ITGA基因家族[8]。研究也发现RP 家族基因通过对mRNA 前体剪切来对生物形态进行控制[9]。本研究分析，卵母细胞在葡萄糖利用的信号通路上存在差异，如柠檬酸循环、三羧酸循环、氧化磷酸化等，这与Wang 等[10]和沈朋雷等[11]研究结果相一致。Yang 等[12]通过对猪卵丘卵母细胞复合体和早期胚胎小RNA 测序研究指出，非编码RNA 在卵母细胞成熟过程中发挥着重要作用，发现PIR84651和MIR574在卵母细胞成熟过程中存在差异表达，这与本次测序结果相同。

3.2 mRNA 的差异表达及其靶基因的分析 通过对转录组学中差异基因分析发现GXT2、SULT2B1、RPS26可能在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。AGXT2（Alanine Glyoxylate Aminotransferase 2）是内源性基因ADMA（Asymmetricdimethyl Arginine）的水解酶之一，参与心血管疾病的调控，但是在Lee 等[13]的研究中发现AGXT2与其他转氨酶具有相似的功能，在大鼠的肾脏中参与氨基酸的代谢，这提示AGXT2可能对卵母细胞氨基酸代谢产生影响。

SULT2B1会影响脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）代谢，DHEA 对卵母细胞作用的机制尚不清楚，但可以肯定的是DHEA 是卵泡内类固醇激素合成的重要前体激素，对卵母细胞成熟有重要作用[14]。通过DHEA 的作用SULT2B1间接对卵母细胞的发育进行调节。

RPS26是参与核糖体合成信号通路小亚基的合成，与40S 小亚基共同调控线粒体ATP 的合成[15]。核糖体作为细胞内蛋白质合成的主要场所，在卵母细胞减数分裂过程中需要大量的蛋白质等物质基础的准备，作为卵母细胞成熟过程中的重要部分，减数分裂中染色体的装配变化是卵母细胞能否正常发育的关键。如果在减数分裂过程中，染色体的复制发生变异，将直接导致卵母细胞合子基因启动的异常，导致后期胚胎不能着床或是胚胎发育畸形，染色体异常[16]。由此可见，RPS26对卵母细胞成熟过程中蛋白质合成及相关蛋白类物质合成起着重要作用。

3.3 lncRNA 的差异表达及其靶基因的分析 本研究对差异表达比较大的lncRNA 进行初步的筛选及相关功能预测发 现，MSTRG.42992、MSTRG.52048这2 个lncRNA 可能对猪卵母细胞成熟调控有较大影响。

MSTRG.42992 相对应的靶基因为 ATP5L。Dahiya等[17]研究发现，ATP5L 参与氧化磷酸化ATP 的产生，在线粒体功能中发挥重要的作用。因此 lncRNA MSTRG.42992 可能通过 ATP5L 调控卵母细胞成熟过程中能量的合成，从而影响卵母细胞的成熟。

MSTRG.52048对应的靶基因为GPC4。在模式动物斑马鱼的研究中发现，GPC4参与 Wnt 信号通路，对斑马鱼的发育有重要的影响[18]。在软骨细胞的发育研究中发现，GPC4基因对细胞生长发育也起着重要的调节作用[19]。而Wnt 信号通路中的关键信号转导分子β-catenin 对促性腺激素释放激素具有重要的调控作用。促性腺激素对卵母细胞体外成熟具有重要的作用，它是卵母细胞与颗粒细胞之间联系的纽带，有助于卵母细胞上卵丘细胞的扩展，对卵母细胞恢复减数分裂进程以及细胞质和细胞核的发育均有促进作用。

虽然差异lncRNA 的靶基因参与卵母细胞成熟过程，但其相对应的靶基因的表达量并不高，因此对于差异lncRNA 如何通过靶基因或是其他方式参与卵母细胞体外成熟的过程仍需要验证探索。目前对猪lncRNA 研究的文献不多，这导致在卵母细胞上相关非编码 RNA的参考数据不够，给猪卵母细胞成熟相关的lncRNA 研究带来阻碍，猪卵母细胞的lncRNA 研究仍然是处于未知的领域，值得深入研究。

4 结 论

通过Illumina 高通量测序结果首次得到猪卵母细胞体外成熟前后GV 与MII 期细胞的 mRNA/lncRNA 表达谱，发现2 个时期共有15 个已知表达差异的lncRNA，共存在4 005 个差异表达的lncRNA。本研究初步发现，AGXT2、SULT2B1、RPS26和MSTRG.42992 、MSTRG.52048这2 个lncRNA 可能参与卵母细胞体外成熟的调控，为后续研究lncRNA 对猪卵母细胞体外成熟提供了科学依据。