纳米银和外源丛枝菌根真菌对甜高粱叶绿素荧光诱导动力学特性的影响

石兆勇，李 珂，王发园，王旭刚，徐晓峰

(1.河南科技大学 农学院，河南 洛阳 471003； 2.青岛科技大学 环境与安全工程学院，山东 青岛 266042)

随着纳米技术的快速发展，纳米材料被广泛应用于人类的生产生活中，并发挥着不可替代的重要作用[1]。而纳米材料在广泛应用的同时，不可避免地进入到了环境中，由此引发的潜在环境风险问题已受到全世界的关注[2-3]。粒径小、比表面积大的特性使纳米颗粒极易吸附固定在土壤颗粒表面，并在土壤中发生迁移、转化、溶解、沉淀、分散、聚集和氧化还原等一系列的复杂反应[4-5]；从而影响植物的生长发育，并能被植物吸收，进入食物链，而引发健康风险。因此，纳米材料对植物的生物毒性效应受到广泛关注[6-7]。

纳米银因其特殊的抗菌特性及催化、超导性能，已成为应用较为广泛的纳米材料[8]，纳米银的毒性效应也得到了广泛关注。研究表明，纳米银对黑麦草存在生物毒性，在低浓度下就会对种子萌发、生理生化及营养生长等起到抑制作用[9]。40 mg·L-1的纳米银抑制黑麦草根毛的形成，并破坏根的表皮、皮层与根冠等组织[10]。当培养溶液中纳米银浓度为10 mg·L-1时，显著降低了供试植物Spirodelapolyrhiza的生物量、叶绿素a含量、叶绿素a/b，以及PSⅡ原初光能转化效率(Fv/Fm)[11]。因此，纳米银在土壤-植物系统的归趋、转化和毒性值得重视[12]。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi， AMF)作为与植物关系最为密切的一类共生微生物，能够与陆地上80%的植物形成互惠共生关系，在改善植物抗逆和抗病方面发挥着重要作用[13-15]。AMF的菌丝对重金属存在一定的吸附作用，通过分泌球囊霉素土壤蛋白等螯合重金属，避免过量的重金属进入植物体内引发毒害[16-17]。研究表明，接种AMF显著缓解了纳米氧化锌引起的负面影响，促进植物的生长和营养元素的吸收，增加光合色素含量和SOD活性，并减少活性氧的积累[18]。在对三叶草的研究中，也发现纳米FeO和纳米银影响到AMF的侵染和促生效应，且随纳米银浓度的增加，AMF缓解纳米银胁迫的能力也逐渐增强，显著降低了植物中银含量和抗氧化酶活性[19]。丛枝菌根侵染率随纳米银浓度增加而下降，而菌根侵染缓解了纳米银对植物的毒性，并且也减少了植物组织中积累的银含量[20]。这些研究表明，纳米银在一定剂量时会抑制植物生长，而AMF可通过多种机制缓解纳米银的毒性。植物的生长与其光合生理特性密切相关，但关于纳米银和AMF共同作用对植物光合生理特性的影响还未见报道。本文以甜高粱为供试材料，探讨了纳米银和丛枝菌根对其叶绿素荧光特性的影响，以期揭示丛枝菌根缓解纳米银毒害的机理。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物为甜高梁[Sorghumbicolor(L.)Moench]，品种为雅津2号。供试AMF为GlomusetunicatumBEG168 (G.e)，培养的宿主植物为玉米、高粱等，培养基质为河沙，去掉植物地上部分，剪碎根段，与根系土壤混合作为菌剂接种物。纳米银颗粒纯度为99.9%，平均粒径为40 nm。供试土壤取自河南科技大学农场，过2 mm筛，风干备用。

1.2 试验设计

试验设置0、0.1、1和10 mg·kg-14个纳米银浓度水平，每个纳米银水平下设置接菌、不接菌，试验共8个处理，每个处理重复4次。选用塑料花盆，每盆装1.5 kg风干土样，采用逐级混匀的方法加入纳米银颗粒，接菌处理每盆加入100 g菌剂，不接菌处理加入等量灭菌菌剂。2017年4月26日播种，每盆均匀播种10颗甜高粱种子，出苗后每盆定苗6株，在日光培养室中培养，平均温度为白天30 ℃，夜间温度为22 ℃，植物生长期间精细管理，进行定期浇水通风，称重法使土壤含水量保持在70%左右，并定期随机调整各盆位置，甜高粱生长90 d后收获植株。

1.3 测定项目与方法

甜高粱收获时将地上部分与根系部分分开收获，收获后用蒸馏水冲洗干净，选取新鲜细根段，用KOH溶液脱色后，醋酸墨水染色，将根段剪成1 cm的小段置于载玻片上在显微镜下观察，参考Trouvelot等[21]方法测定并计算根系菌根侵染率(F)、根系菌根侵染密度(M)、侵染根段菌根侵染密度(m)、侵染根段丛枝丰富度(a)、根系丛枝丰富度(A)。甜高粱生长40 d时，每盆随机选取3株并对叶片相同部位经暗适应20 min后，采用M-PEA(Hansatech，UK)，在光照强度为饱和脉冲光(12 000 μmol·m-2·s-1)条件下，在1 s内，测定OJIP曲线及其相关参数[22]。

1.4 数据统计分析

采用SPSS17.0统计软件对数据进行单因素方差分析，Duncan多重比较各处理之间的差异显著性(P<0.05)，双因素方差分析纳米银施加水平和接种AMF之间的交互作用。

2 结果与分析

2.1 不同纳米银水平处理对丛枝菌根侵染率的影响

由表1可知，与未施加纳米银相比，施加纳米银显著抑制了外源丛枝菌根的M、m、a和A，当纳米银为1 mg·kg-1时根系菌根侵染率最低，但各处理各浓度间均无显著性差异。在未接种外源丛枝菌根菌剂的条件下，甜高粱根系也可被丛枝菌根侵染，表明所选供试土壤中存在土著丛枝菌根且能够侵染根系，而纳米银的施加对土著丛枝菌根无显著影响。

2.2 丛枝菌根真菌对不同水平纳米银处理甜高粱叶片OJIP-test参数的影响

图1显示，不同浓度纳米银和接种丛枝菌根真菌处理对甜高粱初始荧光(Fo)、最大光化学效率(Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(Fv/Fo)和光合性能指数(PIabs)的影响状况。结果表明，在所有4个纳米银浓度处理中，接种丛枝菌根真菌仅在1 mg·kg-1纳米银浓度处理下，显著降低了甜高粱叶片Fo值(图1-A)；而接种丛枝菌根真菌对不同纳米银浓度处理下的Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs则没有显著影响(图1-B，C，D)。

接种丛枝菌根与纳米银对Fo、Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的共同影响表明，除Fo值以在1 mg·kg-1纳米银条件下不接种丛枝菌根真菌最高外，其他3个指标的最高值均出现在0 mg·kg-1纳米银与接种丛枝菌根真菌处理中。

随着纳米银浓度的增加，接菌处理Fo呈现增加的趋势，而对照除在0、0.1和1 mg·kg-1纳米银处理下，也呈现增加的趋势(图1-A)。Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的变化来看，接种菌根处理，随纳米银浓度的变化规律一致，都是逐步降低(图1-B，C，D)；但不接种处理中，除在10 mg·kg-1浓度下，Fv/Fm和Fv/Fo的值略高于1 mg·kg-1浓度处理外，其他3个处理也随纳米银浓度的增加而降低；PIabs值则随纳米银浓度的增加呈现出降低的趋势。

表1 不同纳米银水平处理丛枝菌根侵染率Table 1 Effect of different concentrations of nano-silver on arbuscular mycorrhizal infection rates of sweet sorghum

同列数据后不同字母表示各处理在P<0.05水平差异显著，下同。
Values with different lowercase letters in the same column represented statistically significant (P<0.05) differences among treatments. The same as below.

M，接菌；N，不接菌。图中柱子上方没有相同字母表示差异达显著水平(P<0.05)。M， AMF treatment; N， Control. Different lowercase letters above the columns represented statistically significant (P<0.05) differences among treatments.图1 不同处理对甜高粱Fo(A)、Fv/Fm(B)、Fv/Fo(C)和PIabs(D)的影响Fig.1 Effect of different nano-silver concentrations on Fo(A)， Fv/Fm(B)， Fv/Fo(C) and PIabs(D) of sweet sorghum under different treatments

2.3 丛枝菌根对不同水平纳米银处理甜高粱叶片比活性参数的影响

丛枝菌根和纳米银对甜高粱叶片比活性参数的影响状况列于表2。不同浓度纳米银条件下，接种丛枝菌根后甜高粱叶片比活性参数的8个指标均在1 mg·kg-1下，丛枝菌根处理显著降低了ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo的值，而对ABS/RC、DIo/CSo、TRo/RC和ETo/RC则无显著影响。

从所有接种丛枝菌根和纳米银的8个处理来看，ABS/RC、DIo/CSo和TRo/RC的最大值，均出现于10 mg·kg-1纳米银的接菌处理，而ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo的最大值则都出现在不接种丛枝菌根的1 mg·kg-1处理。

进一步分析菌根和纳米银的双因素影响，表明菌根处理对ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo存在显著的影响，而纳米银则对ABS/RC、DIo/RC、ABS/CSo、DIo/CSo和TRo/CSo这5个指标具有明显的影响；所测定的8个指标都没有受到菌根和纳米银交互作用的影响。

2.4 丛枝菌根真菌对不同水平纳米银处理甜高粱叶片Wk、OEC、Ψo和ΨEo的影响

Wk和OEC能反映PSⅡ供体侧的变化，而ψo和ΨEo能反映PSⅡ受体测光能转化效率的变化[23]。因此，研究了接种丛枝菌根真菌和纳米银共同处理条件下，甜高粱叶片Wk、OEC、Ψo和ΨEo受影响的状况(图2)。Wk和OEC对接种菌根的反应恰恰相反，接种处理分别随着纳米银浓度的增加，呈现出增加和降低的趋势(图2-a，b)。对于Ψo而言，随着纳米银浓度的增加而逐渐降低，但不接菌处理始终高于接菌处理(图2-c)。ΨEo的结果则表明，在所有处理中，接种菌根处理均能被很大程度地提高；且在接菌条件下，ΨEo随纳米银浓度的增加而逐渐增大；对于不接菌对照处理而言，除无纳米银处理外，也随纳米银浓度的增加而增加(图2-d)。

表2 不同处理对甜高粱叶片比活性参数的影响Table 2 Effect of different nano-silver concentrations on leaf activity parameters of sweet sorghum under different treatments

表中数据为不同纳米银浓度处理的参数均是与0 mg·kg-1纳米银且不接种AMF处理的比值；双因素方差分析结果为F值，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
The data under different nano-silver concentration were the ratio between measured value and value in non-AMF and 0 mg·kg-1nano-silver concentration. The results of two-factors ANOVA were represented byFvalue. *， ** afterFvalue meaned statistically significant atP<0.05，P<0.01， respectively.

图2 不同处理下对甜高粱Wk、OEC、Ψo和ΨEo的影响Fig.2 Effect of different nano-silver concentrations on Wk， OEC， Ψo and ΨEo of sweet sorghum under different treatments

3 讨论

纳米银对外源接种的AMF有一定毒性，抑制了菌根侵染植物根系，表现出菌根毒性效应(表1)，这一结果支持了以往的研究结论，如研究表明，施加银和钛纳米颗粒能降低接种Glomusintraradices对向日葵菌根侵染率的45%[23]。Judy等[24]研究了不同浓度硫化银和聚乙烯吡咯烷酮包裹的Ag-NPs对番茄菌根侵染的影响，表明PVP-Ag浓度为100 mg·kg-1时，菌根侵染率明显降低，而对土著AMF侵染却没有显著的抑制作用；这一点与本研究的结果非常类似。

植物叶绿素荧光参数能敏感地反映植物光合作用受环境胁迫的情况[25]。Fv/Fm下降，表明 PSⅡ反应中心最大光能转换效率下降，电子传递量减少，出现光抑制，植物体内过剩光能就可能对光合机构造成损伤[26]。本研究结果显示，纳米银的施加降低了Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的值，同时伴随Fo的升高，表明随施加纳米银浓度的增加，可能导致PSⅡ的伤害程度增加，这与上面所报道的研究结论一致。在一些研究中也得到了证实，如胡文海等[27]对2种辣椒的干旱胁迫的研究就表明，叶片Fo在干旱胁迫下均升高；孙璐等[28]对高粱盐胁迫下的研究也表明，随盐胁迫的加重，Fo也逐渐增加。从相同浓度纳米银处理的接菌和对照Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的结果来看，除了在10 mg·kg-1处理中，接种处理均能保护PSⅡ。而在本研究中，无外源接种AMF条件下，1 mg·kg-1纳米银施加浓度处理显著增加了Fo值，且高于10 mg·kg-1浓度纳米银的处理，以及Fv/Fm和Fv/Fo在10 mg·kg-1时，菌根处理略低于对照的现象，可能与纳米银的毒害机制或特性有关，因为研究表明，高浓度的纳米银具有团聚作用，从而使释放出的银离子浓度降低，对植物的毒性也有所降低[19]。

纳米银和丛枝菌根共同处理对电子传递链供受体侧参数Wk、OEC、Ψo和ΨEo的结果表明，随纳米银浓度的增加，电子传递链供体侧受到的伤害可能逐渐升高(图2-a，b)，这与已有的报道一致，如李旭新等[29]在研究NaCl胁迫时，就表明OEC降低和Wk值升高，进一步表明电子在PSⅡ供体侧的传递受阻，PSⅡ被破坏的程度增强。从电子传递链的受体测参数Ψo和ΨEo来看，Ψo的结果表明，随纳米银浓度的增加，电子传递链受体侧受到的损害程度也呈增加趋势，导致其接收到的电子减少，但从ΨEo的结果来看，其传递电子的数量反而有所增加，这一结果与以往的研究结果以及与Ψo的趋势看似矛盾，但若结合外源菌根接种处理进行分析，就会发现在接菌处理，电子受体侧指标Ψo相对于不接菌对照更低，这可能与丛枝菌根能够帮助寄主植物吸收更多的矿质元素有关，可能在低浓度纳米银(0.1和1 mg·kg-1)条件下，外源丛枝菌根不能识别纳米银的毒害，导致大量吸收纳米银所致；而在高浓度(10 mg·kg-1)时，可能由于纳米银的团聚作用[19]，同样降低了毒性，而加入了丛枝菌根致使其吸收量增加，从而出现了Ψo在接种菌根处理更低的结果。当考虑ΨEo时，可以看出在不接菌的4个处理中，其变化较小，而接菌处理较高，且随纳米银浓度的增加，变化较大，这可能是由于丛枝菌根在吸收纳米银的同时，也吸收了一些有利于缓解纳米银胁迫的矿质元素，从而导致了纳米银的胁迫有所缓解，而致使ΨEo有所增加；因为植物干旱胁迫条件下，施加Si元素也能显著提高ΨEo值[30]，而关于接种丛枝菌根提高植物对各类矿质营养元素的吸收、转运和分配已经被证实[31-32]。当然，也有可能是其他原因造成的，有待进一步探讨。

甜高粱叶片比活性参数DIo/RC和DIo/CSo在纳米银施加后均增加，表明热耗散机制被启动，可以防御过剩激发能的增加，这可能是植物对纳米银伤害的一种防御机制。然而，ABS/RC和ABS/CSo的结果表明，纳米银对比PSⅡ反应中心仍造成了伤害，降低了PSⅡ的光能效率。从参数TRo/CSo和ETo/CSo来看，二者呈现相同的规律，都是在1 mg·kg-1浓度下，菌根效应显著，而在其他纳米银浓度下则无效应，这可能是在1 mg·kg-1的纳米银浓度下，接种丛枝菌根真菌而导致了植物所受到伤害更大，这可能是在该浓度条件下，丛枝菌根真菌没有识别纳米银为污染物所导致的；这一结果与电子传递链的受体测参数Ψo的结果是一致的；但总体来看与ΨEo的结果呈现出矛盾的趋势，这有待进一步探讨。

综上所述，纳米银对外源AMF有一定毒性，抑制菌根侵染植物根系。随纳米银施加浓度增加，造成PSⅡ受到伤害，而接种外源丛枝菌根能在一定程度上缓解纳米银的毒害，但其机制有待进一步探讨。