稳定性同位素氘标记苏丹红I-D5的均匀性分析

蔡银萍

(滨州职业学院，山东 滨州 256600)

均匀性是标准物质最基本的属性之一，是标准物质制备过程中的关键要素。为了检验样品是否均匀，通常随机抽取一定数量的样品，采用精密度高的实验方法，对抽取的样品在同样的实验条件下进行测定，从而使样品间的差异完全由样品本身的不均匀性反映出来[1-2]。

根据国家标准物质技术规范的要求：候选物应满足适用性、代表性，以及容易复制的原则[2]。候选物的均匀性的量值范围应适合该标准物质的用途。对于分装成的最小包装单元的标准物质必须进行均匀性检验，同时抽取的单元数目对样品的总体要求要有足够的代表性，抽取的单元数取决于总体样品的单元数和对样品均匀程度的了解。

1 检验方法及判断依据

按照《标准样品工作导则(5)：化学成分标准样品技术通则》(GB/T15000.5-94)对所研制的标准品均随机抽取n瓶，以其中一瓶作为基本比对点，其余n-1瓶作为检验点，采用相应的数理统计方法对各标准品的均匀性进行检测和研究。采用F检验法和t检验法联合进行均匀性检验。

所研制的苏丹红-I-D5标准品分装成5 mg/瓶，共344瓶。

随机抽取15瓶样品，任选其中一瓶作为基本对比点，连续进行14次测试(14次样品转化，平行测定)；其余14瓶作为检查点，每瓶各测试一次(平行转化与测定)；分别计算平均值和方差，以F检验法和t检验法联合进行均匀性的检验。

用F检验法检验所取样本方差的显著性差异，有下列判断公式：

式中：S12―数值较大的方差；S22―数值较小的方差；ν1，ν2分别为计算S12和S22的自由度，本课题组取ν1=ν2=14-1=13；Fα(ν1，ν2)―给定显著性水平α及自由度(ν1，ν2)的统计检验的临界值，查表Fα(13，13)=2.58，当满足判定公式(1)时，则两组的方差不存在显著性差异。

用t检验法检验两组的平均值是否存在显著性差异，有下列判断公式：

将式(3)和式(4)代入式(2)，整理得

当满足(5)式时，则两组平均值不存在显著性差异。若F检验法和t检验法的检验结果不存在显著性差异，则说明该标准物质是均匀的。

2 实验方法

2.1 抽样方法

2.2 抽样方式

按随机数表抽取样本，去除重复和无用的，抽取15瓶苏丹红-I-D5样品号为：3,24,56,97,117,132,140,147,167,227,234,244,258,299,327。将其编号为：S1,S2,S3,S4,S5,S6,S7,S8,S9,S10,S11,S12,S13,S14,S15。

2.3 检验项目

本标准物质有2个特征值：含量(质量分数%)和D的同位素丰度(mol%或atom%)。

检验项目2个：①采用高效液相色谱对所研制的标准物质的含量进行检测，外标法定量；②分别采用电喷雾质谱仪和气体同位素质谱计对苏丹红-I-D5的同位素丰度进行测定。

记录结果，以F检验法和t检验法检验苏丹红-I-D5的2个特性量值的均匀性，结果见表1～6。

2.4 检验用仪器与色谱/质谱条件[3-4]

用液相色谱法检验其纯度；用电喷雾质谱仪检验其同位素D(2H)的丰度(mol%或atom%)。

苏丹红-I-D5的化学纯度分析方法：高效液相色谱仪，型号：高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC：日本岛津LCMS-2020)；色谱柱：C18柱(150 mm×4.6 mm (I.D.)，5 m，GL Sciences lnc)；流动相A：0.3%甲酸的水溶液∶丙酮=3∶1；流动相B：乙腈；A∶B=25∶75；进样量：10 L；柱温：30℃；流速：1 mL·min-1，分流器分流0.8 mL·min-1；特征波长： =478 nm；流动相A、B按比例混匀(A∶B=25∶75)，配置浓度为0.5，1，2，5和10 g·mL-1的标准分析液。进行HPLC外标法分析，绘制标准曲线并求出对应关系式。

苏丹红-I-D5的同位素丰度分析方法：采用TSQ Quantum Access 高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪 (美国，Themo Scientific公司)分析氘标记的同位素丰度。电喷雾电压：4 kV；调谐滤镜电压：70 V；干燥气流量：10 L·min-1；雾化气流量：4 L·min-1；加热模块温度：350℃；脱溶剂管温度：250℃；单扫描时间：0.1 s；蠕动泵流速：10μL·min-1；扫描模式：负离子模式；扫描范围：m/z=([M-H]- 10) dalton=(242～262) dalton；谱图叠加次数：> 20；平行实验次数：3次。

3 苏丹红-I-D5的化学纯度的均匀性分析

在本实验中，选择S10作为对比组，其他的作为检测组。

表1、表2为苏丹红-I-D5的化学纯度的检测结果，表3为苏丹红I-D5的化学纯度检验结果的F检验法和t检验法的统计检验结果。

表1 对比组纯度检验结果

表 2 检验组纯度结果

表3 数理统计检验结果

表3(续)

在显著性水平α=0.05，检测组和对比组的自由度均为13的情况下(F0.05(13，13)=2.58，t(0.05,26)=2.056)，纯度结果的测定方差无显著性差异，测定平均值无显著性差异。1系列图表说明苏丹红-I-D5的化学纯度均匀性良好。

4 苏丹红-I-D5的同位素丰度的均匀性分析

在本实验中，选择S10作为对比组，其他的作为检测组。

表4、表5为D同位素丰度的检测结果，表6为D同位素丰度检验结果的F检验和t检验的统计检验结果。

表4 检验组同位素丰度结果

表5 对比组同位素丰度结果

表6 数理统计检验结果

在显著性水平α=0.05，检测组和对比组的自由度均为13的情况下(F0.05(13，13)=2.58，t(0.05,26)=2.056)，D同位素检验结果的测定方差无显著性差异，测定平均值无显著性差异。2系列图表说明氘同位素丰度均匀性良好。

5 结果与讨论

苏丹红-I-D5标准物质为红色固体纯品，以电喷雾质谱仪对其同位素丰度特性值进行检验、以高效液相色谱仪(HPLC)对其含量特性值检验合格后，在干燥、洁净的分装实验室进行分装。经HPLC和MS对两种标准物质的特性值进行均匀性检验和稳定性监测，结果显示：均匀性良好，并通过F和t检验。