蓝莓果实常温贮藏过程中表面病原真菌的分离与鉴定

周 倩 冯 肖 纪淑娟 魏宝东 周 鑫 王斯瑶 王亚娟 郝 佳

（沈阳农业大学食品学院 沈阳110866）

蓝莓又称越橘，俗称都市果，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium spp.），为多年生灌木小浆果果树，耐寒性极强，可抵御-50℃的严寒，原产于北美、苏格兰和俄罗斯，是一种具有极高经济价值的新兴世界性小浆果[1]。随着蓝莓种植面积的增加和种植年限的增长，其病害的发生也比较普遍，由于蓝莓果实柔软、皮薄、多汁、营养成分丰富，因此在采后极易受到微生物的侵染，导致果实表面凹陷、破裂，霉菌沿裂缝处开始繁殖蔓延，造成全果腐烂变质[2]。蓝莓果实病害具有发生普遍、侵染部位多样、发病时期持久、影响产量和品质等特点[3]。侵袭采后蓝莓的病原真菌很多，还存在一定的地域差异性：西班牙、美国、智利、阿根廷等地的病原菌主要是灰霉菌（Botrytis cinerea）、炭疽菌（Colletotrichum spp．）、链格孢菌（Alternaria spp．）、枝孢菌（Cladosporium spp．）、青霉菌（Penicillium spp．）、镰刀菌（Fusarium spp．）和根霉菌（R hizopus spp．）[4-7]。国内一些地区的蓝莓贮藏病害致病病原真菌已被分离鉴定出几种常见的病原真菌，包括灰葡萄孢、青霉、链格孢霉、褐孢霉[8]。其中，灰霉病是蓝莓的主要病害之一[9-10]。

本试验中针对辽宁地区的“蓝丰”蓝莓果实为试材，通过对蓝莓采后常温贮藏过程中自然发病果实表面病原菌的分离与筛选，明确采后蓝莓腐烂的主要病原菌的种类。采用传统混菌法对表面病原真菌进行培养和纯化，经形态学观察分析，初步确定蓝莓表面病原真菌种类，并进行返接试验。对真菌核糖体基因ITS区进行特异性PCR扩增，对病原真菌分类鉴定。采用该技术对植物病原真菌的分子检测已在国际上广泛应用[11]。通过生理生化实验确定所鉴定菌种的最适生长温度，为蓝莓果实贮藏保鲜过程中病害的预防和控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓品种为“蓝丰”，采摘当天，选取成熟度相同，果实饱满，无病虫害，大小均匀一致的果实运回沈阳农业大学试验室。分装后置于室温（20±0.5）℃贮藏。

1.2 仪器与设备

显微镜，日本OLYMPUS公司；FA-004电子分析天平，上海精科科技有限公司；PCR仪，美国Thermo Fisher scientific公司；电泳仪和电泳槽，北京市六一仪器厂；凝胶成像仪Amershan Imager 600，美国GE公司；酶标仪，美国博腾仪器有限公司；台式高速离心机，上海天美生化仪器设备工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓病原真菌的分离纯化 称取蓝莓10 g，于90mL无菌生理盐水中混匀，制成质量浓度为10-1g/mL的菌混液。取1mL于9mL无菌生理盐水中，制成质量浓度为10-2g/mL的菌混液，同理制得质量浓度10-3g/mL的菌混液。分别取10-1，10-2，10-3菌混液1mL涂布于孟加拉红培养基中，28℃倒置培养48 h以上，每个梯度的菌混液分别重复4次涂布试验。待菌落长出，观察分离出的菌株的菌落形态。选择生长形态不同的病原真菌，挑取边缘菌丝转接到新的孟加拉红培养基上培养，于28℃条件下倒置培养5～7 d，连续培养3～5次，使其在培养基上出现单一菌落，从而使蓝莓表面病原真菌得到分离纯化。

1.3.2 返接试验 选取新鲜无病害的蓝莓用体积分数75%乙醇浸泡5 s，无菌水清洗3次后取出、晾干备用[12]。用灭菌针头在每个果实腰部穿刺，挑取纯化好的菌丝接入孔内。每种菌接种4～6颗蓝莓，放于灭菌培养皿中，用纱布盖好，常温保存3～5 d，观察发病情况。分离纯化返接试验蓝莓果实上的病原真菌，观察是否与此前分离纯化菌种相同。

1.3.3 蓝莓病原真菌的生态学鉴定 将纯化后的病原真菌置于培养基中培养5～10 d，观察其纯化菌株的菌落形态、性状、色泽。采用插片法，在接种菌丝的孟加拉红培养基中插入灭菌的盖玻片，培养3～5 d后取出盖玻片于显微镜下观察其菌株的分生孢子及分生孢子梗的形状、色泽，分生孢子纵横隔膜的数目等性状，通过与有关文献对比，参照真菌形态学鉴定手册和中国真菌志[13-15]对病原真菌种类进行初步鉴定，确定主要病原真菌。

1.3.4 蓝莓病原真菌DNA的提取 取新鲜菌体100mg加入液氮充分研磨，将研磨后的粉末收集到离心管中，参照康为世纪新型植物基因组DNA提取试剂盒提取。收集DNA溶液于-20℃保存。

1.3.5 蓝莓病原真菌ITS区的PCR扩增 在50 μL反应体系中加入25μL 2×Taq MasterMix（Dye）、2μL Forward Primer，10μmol/L、2μL Reverse Primer，10μmol/L、0.5μL Template DNA，加ddH2O补足50μL。PCR反应条件：95℃预变性2min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次，72℃终延伸2min。

1.3.6 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析 将0.2 g琼脂糖粉末倒入20mL的TAE缓冲液中，煮开2次，加入EB染料，倒入配胶板中，得到质量分数为1%的胶版。PCR体系反应结束后，从获得的体系中分别取出体积为5μL的PCR产物，加入凝固好的胶片中，同时加入5μL Marker 2000作为对照。将电泳条件设定为电压U=95 V，电流I=400mA，时间T=20min。电泳结束后，经凝胶成像分析系统成像，观察是否有明亮单一的特异性条带[16]。

1.3.7 蓝莓病原真菌的相似性分析 将PCR产物送金唯智公司测序，利用SnapGene软件处理测序结果后，将其提交到NCBI，使用GenBank中的Blast软件在线比对，并下载相似的参比ITS rDNA序列，然后用MEGA7.0[17]软件（Neighbor-Joining法）构建系统发育树，对其序列的相似性进行分析。

1.3.8 温度对蓝莓病原真菌生长的影响 在培养3~7 d的不同病原真菌的菌落边缘用直径为5 mm的打孔器打取菌苔，倒置接种于孟加拉红平板上，分别在20，22，24，26，28，30℃的恒温培养箱中黑暗条件下培养5 d。用十字交叉法[18]测量菌落直径。每个温度设3个重复，分析不同菌在不同温度下的生长情况。

1.4 数据统计与分析

运用NCBI Blast对ITS区扩增产物序列进行在线比对，采用MEGA7.0构建系统发育树，采用Excel 2010对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 蓝莓病原真菌菌落形态描述

蓝莓病原真菌菌落如图1、图2、图3所示，经3~5次分离纯化，分离出3种真菌，分别命名为L、T、H。

真菌L菌落呈绒状，后期颜色加深，逐渐生长为墨绿色，菌落平整，边缘整齐，有白色绒毛。底部呈现轮纹状。

图1 真菌L菌落形态Fig.1 Colony morphology of fungi L

图2 真菌T菌落形态Fig.2 Colony morphology of fungi T

图3 真菌H菌落形态Fig.3 Colony morphology of fungi H

真菌T具辐射状皱纹，边缘菌丝体白色，质地绒状，分生孢子结构大量，蓝绿色，5～7 d后有少许浅黄色渗出液和可溶性色素，菌落反面呈浅黄褐色。

真菌H菌落呈绒毛状。颜色由浅黄色逐渐转变为深黄，5～7 d后逐渐变为黑褐色绒状或带粉状，生长迅速，边缘毛糙。

2.2 返接试验结果

如图4～6所示，在返接的蓝莓上观察到菌丝，接种的发病率为100%。其腐败变质的状态与自然状态下蓝莓腐败变质状态相同。从接种发病的蓝莓果实上挑取菌丝再次分离纯化，其形态性状与原微生物相同，得到同种病原真菌。依照柯赫氏法则，可知此3类病原真菌为蓝莓货架期病害的主要致病菌[19]。

图4 真菌L返接蓝莓试验结果Fig.4 The results of fungi L return blueberry test

图5 真菌T返接蓝莓试验结果Fig.5 The results of fungi T return blueberry test

图6 真菌H返接蓝莓试验结果Fig.6 The results of fungi H return blueberry test

2.3 病原真菌的形态

如图7、图8所示，顶端稍膨大，有指状分枝，呈扫帚状，分枝上有一串孢子，分生孢子球形，分生孢子链稍叉开而呈现疏松的柱状，初步断定为青霉属。

图7 真菌L显微镜下形态Fig.7 The morphology of fungi L under the microscope

图8 真菌T显微镜下形态Fig.8 The morphology of fungi T under the microscope

如图9所示，分生孢子单生，分生孢子梗分枝，次生分生孢子梗或孢子侧向分枝，形成矮树状分枝的分生孢子短链，初步断定为链格孢属。

2.4 蓝莓病原真菌ITS区PCR扩增产物凝胶电泳成像

图10显示蓝莓病原真菌ITS区PCR扩增产物凝胶电泳结果。在600 bp左右有条带出现，符合真菌ITS区序列长度范围[20]，表明ITS区通用引物成功地扩增了蓝莓病原真菌的ITS区基因序列。

图9 真菌H显微镜下形态Fig.9 The morphology of Fungi H under the microscope

图10 PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.10 Gel electrophoresis of the product by PCR

2.5 蓝莓病原真菌ITS区序列分析

利用NCBI中的Blast程序在线分析所提取的3种病原真菌的PCR扩增片段序列，与Gen-Bank中已有的相关菌株的ITS序列进行同源性比较，覆盖率均超过90%，同源性超过90%。下载相似菌株序列，确定该菌株的系统发育位置，基于部分同源性较高的菌株用MEGA7.0构建系统发育树（如图11～13）。

病原真菌L、T、H的PCR扩增长度分别为554，560 bp和545 bp，所测序列在提交至NCBI中的Blast比对后，病原真菌L和T得到的同源性较高的菌株的ITS序列都是青霉属，病原真菌H得到的同源性较高的菌株的ITS序列都是链格孢属菌种。

图11表明真菌L与尖海龙共附生真菌（Talaromyces amestolkiae）LT558951.1、青霉菌KP900322.1、青霉菌KP900320.1等的亲缘关系较近，结合对病原真菌L的形态分析和ITS序列的相似性分析结果，确定真菌L为真核生物，菌类，双核亚界，子囊菌门，盘菌亚门，散囊菌纲，散囊菌亚纲，散囊菌，曲霉科，青霉。

图11 基于真菌L的ITSrDNA序列分析的系统发育树Fig.11 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on fungi L

图12表明真菌T与产黄青霉KU743900.1、产黄青霉KU743899.1、灰玫瑰青霉（Penicillium griseoroseum）KY218671.1等的亲缘关系较近，结合对病原真菌T的形态分析和ITS序列相似性分析结果，确定真菌T为真核生物，菌类，双核亚界，子囊菌门，盘菌亚门，散囊菌纲，散囊菌亚纲，散囊菌，曲霉科，青霉，产黄青霉菌种复合物。

图12 基于真菌T的ITSrDNA序列分析的系统发育树Fig.12 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on fungi T

图13表明真菌H与链格孢菌KF380791.1、链格孢菌KP003824.1、极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）KR912296.1等的亲缘关系较近，结合对病原真菌H的形态分析和ITS序列的相似性分析，确定真菌H为真核生物，菌类，双核亚界，子囊菌门，盘菌亚门，座囊菌纲，格孢菌亚纲，格孢腔菌目，孢腔菌科，黑斑，链格孢组。

2.6 温度对蓝莓病原真菌生长的影响

表1～3所示不同种病原真菌在不同温度下连续培养5 d菌落直径的变化趋势。

通过研究不同温度对蓝莓病原真菌生长的影响，结果表明：青霉最适生长温度28℃，除第1天在26℃生长较快外，之后都是28℃生长最快，20℃或30℃以上生长均较缓慢且高温会抑制该真菌的生长。产黄青霉第1天的适宜生长温度在24℃左右，之后在26℃生长较快，从第3天开始最适生长温度在26～28℃之间，没有明显的差异，20℃和30℃以上均生长较为缓慢。链格孢霉的适宜生长温度均为26℃，低温抑制该真菌的生长。

图13 基于真菌H的ITSrDNA序列分析的系统发育树Fig.13 Phylogenetic tree of ITSrDNA sequence analysis based on Fungi H

表1 不同温度下青霉菌落的直径Table1 Chrysosporium colony’s diameter at different temperatures

表2 不同温度下产黄青霉菌落的直径Table2 Diameter of Penicillium chrysogenum at different temperatures

表3 不同温度下链格孢霉菌落的直径Table3 Diameter of Alternaria alternata at different temperatures

3 讨论

蓝莓是具有较高经济价值和广阔开发前景的新型果树树种，其果实具有防止脑神经衰老，增强心脏功能，明目及抗癌等独特功效[21]，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一。然而蓝莓果实成熟于6-8月份的高温多湿季节，采后极易变质、腐烂，因此研究蓝莓果实贮藏过程中病害机理，从而开发出成本低廉、操作简便、安全高效的保鲜方法是今后蓝莓保鲜技术研究的重点。

引起果品腐败的微生物通常包括细菌、霉菌和酵母，以细菌和霉菌引起的果品腐败最为常见。据报道，蓝莓病害微生物主要有45个属[22]。国外关于蓝莓贮藏病害的研究报道主要集中在采后病害防治[23]，而在国内，已分离出的细菌菌种包括沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属[24]。金义兰等[25]针对贵州部分蓝莓种植基地的蓝莓病害进行调查发现灰霉菌是蓝莓主要病害真菌。梁晨等[9]针对北方地区栽培的蓝莓采后病害致病病原菌分离鉴定出几种常见的真菌，包括灰葡萄孢、青霉、褐孢霉、链格孢和枝顶孢等。徐成楠等[26]研究表明辽宁省部分地区蓝莓采后病害主要是由尖孢炭疽菌和胶孢炭疽菌引起的。蓝莓果实采后多采用冷藏法抑制细菌的滋生，贮藏效果并不十分明显[27]。目前，国内蓝莓产业化已初步形成，而其成熟后感染霉菌会导致运输和贮藏过程中大量腐烂，严重影响其采后保鲜。对于蓝莓而言，从源头发现染病果实并及时处理，对减少其贮藏损失尤为重要。在蓝莓生长期，可通过彻底清园、加强管理、药剂防治等方法防止蓝莓被霉菌侵染[28]。蓝莓在贮藏期间能否长时间贮藏与本身的质地、成熟度和所处环境的温、湿度以及是否感染病原真菌有着密切的关系。果实采摘后，在果实采收、包装、运输过程中划伤或挤压造成的微伤口，是微生物侵染的主要途径[29]。

本试验通过对辽宁地区蓝莓常温贮藏过程中表面病原真菌的分离纯化，结合传统真菌形态鉴定和PCR扩增测序的分子生物学鉴定，对蓝莓贮藏期间主要病原真菌进行诊断和分析。确定引起蓝莓贮藏期腐败变质的病原真菌为青霉、产黄青菌和链格孢霉，这3种真菌皆属腐烂致病菌，可导致贮藏期蓝莓腐烂。本试验结果具有较高的普遍性，在不同品种的果蔬中经常发现感染青霉菌或链格孢霉菌。霉菌侵染果后，不仅果实外观受影响且降低果实品质，还产生毒素，危害到人体的健康[30]。本试验对蓝莓贮藏期表面病原真菌进行初步的分离鉴定和序列诊断，确定其种类。其在贮藏期的传播途径、发生规律、致病机制[31]等还需进一步的研究。

本试验最终通过对不同病原真菌在不同温度下的生长速率的分析，得出高温和低温均可抑制病原真菌的生长。虽然高温贮运过程中有些病原真菌几乎不生长，但是高温易造成脱水变质。因应适时采收，并尽快进行预冷处理，在低温下贮藏，以减少病原真菌的侵染，降低病害的发生率，进而减少经济损失。