灰树花中改善脂质代谢活性组分的筛选及其提取工艺优化

周文斌 洪家丽 李 路 李 燕 黄梓芮 郭伟灵 倪 莉 饶平凡 刘 斌 吕旭聪，3，*

（1 福建农林大学食品科学学院 福州350002

2 福建农林大学 国家菌草工程技术研究中心 福州350002

3 福建农林大学生命科学学院 福州350002

4 福州大学食品科学技术研究所 福州350108）

近年来，不良的生活习惯使得肥胖和脂质代谢紊乱在人群中的发生比例越来越高[1]。脂质代谢紊乱与高血压、Ⅱ型糖尿病、缺血性心脑血管疾病等慢性病的发病紧密相关[2]，不仅影响生活质量，而且会危及生命。虽然目前临床上有许多降脂药物被广泛应用，但长期服用此类药物会产生依赖性及明显的副作用。挖掘安全、有效的天然食源性活性物质来改善脂质代谢紊乱已成为食品营养学领域的研究热点[3-4]。

灰树花又名栗子蘑，贝叶多孔菌，莲花菌，日本称之为舞茸[5]。其香味浓郁，质地脆嫩，口感极佳，营养价值高，人体氨基酸含量高，维生素及矿物质含量丰富，在民间有悠久的食用历史，是一种食、药兼用的珍稀食用菌[6-7]。灰树花中含有大量的活性物质，具有抗癌，抑制高血压，抑制肥胖症，预防动脉硬化，促进肝功能增强，改善脂质代谢等多种生理活性[8-9]。然而，灰树花中具体是哪些组分具有改善脂质代谢作用至今尚未明确。改善脂质代谢活性组分的体外筛选方法主要有体外模拟胆汁胶束法、脂肪酶抑制剂筛选法、细胞内胆固醇流出法和基于肝脏X受体激活剂的细胞筛选模型等[10-11]。细胞内胆固醇流出法和肝脏X受体激活剂这两种方法均需要进行细胞培养和造模，不仅费时费力，而且生物重现性有待提高。体外模拟胆汁胶束法和脂肪酶抑制剂筛选法具有灵敏可靠、简单易行、实用性强的优点[12]。

本文旨在寻找灰树花中具有改善脂质代谢紊乱的活性组分。采用顺序溶剂提取不同极性的灰树花提取物，然后通过模拟胆汁胶束和脂肪酶抑制两种体外筛选方法，快速筛选灰树花中具有改善脂质代谢的活性提取物，最后利用单因素以及响应面法进一步优化提取工艺[13]，并通过UPLCQTOF-MS/MS方法对灰树花活性提取物进行组分鉴定[14]。本研究结果对于灰树花及其活性产物的应用推广具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灰树花，购于井冈山井祥菌草生态科技股份有限公司；胆酸盐，上海源叶生物科技有限公司；总胆汁酸和脂肪酶测试盒，南京建成生物工程研究所（货号分别为E003、A054）；己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、无水乙醇、无水碳酸钠等，国药集团化学试剂有限公司，纯度为国药分析纯级。

1.2 仪器与设备

紫外-可见分光光度计（UV-1800），上海美谱达仪器有限公司；电子天平（AL204），梅特勒-托利多仪器有限公司；离心机（SL-3612），科大创新股份有限公司中佳分公司；旋转蒸发仪（R201），上海申生科技有限公司；超声波清洗器（KQ-500VDE），昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 灰树花中改善脂质代谢活性组分的提取方法 称取50 g灰树花粉末，分别用己烷、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和去离子水对灰树花粉末依次进行溶剂提取。加入500mL己烷，在室温下悬浮振摇（200 r/min）2 h，混合液离心沉淀后，取上清液真空抽滤，残渣晾干后加入下一个溶剂重复上诉步骤，收集滤液获得己烷提取物（HE）、氯仿提取物（CE）、乙酸乙酯提取物（EAE）、甲醇提取物（ME）和水提取物（WE）。上述有机提取物经真空旋转浓缩，所得浓缩液于37℃烘干至恒重，WE冻干并称重。HE、CE、EAE用二甲基亚砜（DMSO）溶解，ME、WE用去离子水溶解待测。

称取50 g灰树花粉末，利用不同浓度的乙醇溶液提取灰树花，分别与500 mL乙醇溶液（体积分数分别为100%，80%，60%，40%，20%，0%）在40℃，400W超声提取30min，依次获得100%EE、80%EE、60%EE、40%EE、20%EE、0%EE滤液，真空浓缩至膏状，冻干并称重。用二甲基亚砜（DMSO）溶解待测。

1.3.2 模拟胆汁胶束法体外筛选 TBA酶标仪微板测定法：将相应的胆酸盐溶于生理盐水中制成浓度为2μmol/mL的胆酸盐溶液。吸取0.5mL 80 mg/mL的各组分提取物，加入1 mL盐酸溶液（0.01mol/L）于37℃恒温振荡消化1 h，再加入0.1mL氢氧化钠溶液（0.1mol/L），混匀，加入5mL胆酸盐溶液（含10mg/mL的胰酶），密封，置于37℃振荡培养1 h，10 000 r/min离心10min，取上清液待测。

使用总胆汁酸（TBA）测试盒（货号：E003，酶比色法，南京建成）。按试剂盒说明书操作，配制试剂1应用液（试剂B液倒入试剂A液中，VA液∶VB液=9∶1，混匀），将30μL样品加入240μL试剂一应用液，混匀，37℃培养3～5min，在波长505 nm处读取吸光度（A1）。加入60μL试剂2，混匀，37℃培养5min，在波长505 nm处读取吸光度（A2）。

△A=A2-A1

游离TBA含量C（μmol/L）=△A测定/△A标准×标准品浓度（μmol/L）

结合率=[10（μmol）-C（μmol/L）×6.6（mL）]/10（μmol）

1.3.3 脂肪酶抑制体外筛选 利用0.1 mol/L KH2PO4-K2HPO4缓冲液（pH7.4）配制0.5 mg/mL胰脂肪酶。采用南京建成的脂肪酶试剂盒，货号为A054。取底物溶液在37℃预热5min，加入4mg/mL样品，立即混匀，10min后加入胰脂肪酶溶液，快速混匀，在波长420 nm处读取吸光度值A1。将此比色液于37℃水浴10min，在波长420 nm处读取吸光度值A2。求出2次测定的吸光度的差值（△A1=A1-A2）。

脂肪酶活力（U/L）=△A/As×标准品浓度（454 μmol/L）×反应液体积（205μL）/取样量（5μL）/反应时间（10min）

抑制率（%）=（1-△A2/△A1）×100

△A1=A1-A2，△A2=A3-A4

式中：A1、A2、A3、A4与As分别为空白组（只有底物）、无抑制剂组（酶和底物）、对照组（抑制剂和底物）、加抑制剂组（酶、底物和抑制剂）和标准品在波长420 nm处的吸光度。

1.3.4 灰树花乙酸乙酯EAE提取物的提取工艺单因素试验 取灰树花粉末按1∶10的料液比加入己烷，室温悬浮振摇（200 r/min）2 h，混合液经真空过滤，残渣晾干后加入氯仿，重复上述步骤，晾干残渣备用。

1.3.4.1 料液比对提取物得率的影响 准确称取上述残渣，各加入料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶25、1∶50（g/mL）的乙酸乙酯，在400W功率下超声提取5min，于20℃200 r/min摇床悬浮2 h，将混合物真空抽滤，收集滤液。有机滤液真空浓缩，于37℃烘干至恒重。

1.3.4.2 超声时间对提取物得率的影响 准确称取50 g上述残渣，加入500mL乙酸乙酯，在400 W功率下超声提取0，10，20，40，60min，于20℃200 r/min摇床悬浮2 h，将混合物真空抽滤，收集滤液。有机滤液真空浓缩，于37℃烘干至恒重。

1.3.4.3 提取温度对提取物得率的影响 准确称取50 g上述残渣，加入500mL乙酸乙酯，在400 W功率下超声提取5min，分别于20，30，40，50℃200 r/min摇床悬浮2 h，将混合物真空抽滤，收集滤液。有机滤液真空浓缩，于37℃烘干至恒重。

1.3.5 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工艺响应面优化设计 根据1.3.4节单因素试验结果，分别选取料液比（A）、超声时间（B）、提取温度（C）3个因素为自变量，以提取率作为响应值，利用Design-Expert8.0软件中的Box-Behnken Design进行灰树花EAE提取工艺的响应面优化分析设计。设计的因素水平见表1。

1.3.6 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）中组分的LC-MS/MS分析鉴定 色谱条件：BEH C18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）；流动相为0.05%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）。采用梯度洗脱程序：0～0.5min 98%A～90%A，0.5～3min 90%A～75%A，3～18min 75%A～65%A，18～27min 65%A～98%A，最后用98%A持续3min；柱温45℃，流速0.6mL/min。

表1 响应面设计因素水平表Table1 Factors and levels of the response surface design

质谱条件：离子源：ESI；检测方式：负离子电喷雾模式；扫描范围50～1 200 u，扫描时间：0.10 s；毛细管电压3.0 kV，锥孔电压25 V；去溶剂气N2，去溶剂气温度450℃；源温度120℃；去溶剂气流速500 L/h；低碰撞能量扫描的碰撞能量为2 V，高碰撞能量扫描的碰撞能量为30～70 V。质谱仪和UPLC系统由MassLynx 4.1软件（美国Waters公司）控制。

2 结果与分析

2.1 灰树花不同溶剂提取物得率

灰树花经上述方法提取，分别得到11种组分，各提取组分的得率见表2。其中，水提物的得率最大，为25.18%；灰树花EAE的得率最低，仅0.30%。2种提取方法普遍出现溶剂极性越高，得率越高的现象。

表2 不同溶剂提取的灰树花活性组分得率Table2 The yields of active components from Grifola frondosa

2.2 灰树花不同溶剂提取物对胆酸盐结合的能力

活性组分对脱氧胆酸钠和胆酸钠结合越多，越能降低机体的脱氧胆酸钠和胆酸钠含量，促进胆固醇向胆汁酸的转化，从而降低肝脏中的胆固醇累积，促进血液中胆固醇向肝脏中转移，达到降血脂的效果。灰树花不同溶剂提取物（质量浓度80mg/mL）对脱氧胆酸钠的结合能力见图1。不同提取物（质量浓度80mg/mL）对脱氧胆酸钠的结合能力分别为EAE＞CE＞HE＞ME＞100%EE＞80%EE＞60%EE＞0%EE＞40%EE＞20%EE＞WE。其中，灰树花EAE的结合量最高，达24.59μmol/100mg。

灰树花不同溶剂提取物（浓度80mg/mL）对胆酸钠的结合能力见图2。不同提取物（质量浓度80mg/mL）对胆酸钠的结合能力分别EAE＞CE＞100%EE＞HE＞ME＞80%EE＞60%EE＞20%EE＞WE＞40%EE＞0%EE。其中，灰树花EAE的结合量最高，达22.19μmol/100mg。

2.3 灰树花不同溶剂提取物对胰脂肪酶的抑制活性

由图3可知，作为目前市场上最成功的胰脂肪酶抑制剂-奥利司他在相同试验条件下对胰脂肪酶抑制效果最好，其抑制率达96.84%。不同灰树花提取物（质量浓度4mg/mL）对胰脂肪酶的抑制效果最好，其抑制率达96.84%。不同灰树花提取物（质量浓度4mg/mL）对胰脂肪酶的抑制能力相差很大，为EAE＞HE＞40%EE＞100%EE＞0%EE＞ME＞80%EE＞WE＞20%EE＞CE＞60%EE。其中EAE抑制脂肪酶的活性最高，达73.15%。

图1 微板法灰树花不同溶剂提取物与脱氧胆酸钠的结合能力Fig.1 The binding of sodium deoeycholate of different extracts from Grifola frondosa by microplate method

图2 微板法灰树花不同溶剂提取物与胆酸钠的结合能力Fig.2 The binding of sodium cholate of different extracts from Grifola frondosa by microplate method

2.4 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工艺的单因素试验

由于筛选的灰树花活性组分乙酸乙酯EAE提取物提取率很低，所以对其进行单因素和响应面优化试验，确定其最佳工艺条件，以提高其得率。

2.4.1 料液比的选择 料液比是利用物质在固相和液相之间存在的浓度差，即其在两相间的传质推动力，影响物质的提取率。适当增大液料比，增大两相间的浓度差时，可促进固相中物质向液相中释放和扩散。如图4所示，液料比在5∶1到25∶1之间，随着溶剂的增大，提取率逐渐增大。当溶剂液料比超过25∶1时，提取中溶剂增加得率不再增大。最终选择液料比为25∶1（mL/g）。

2.4.2 超声时间的选择 如图5所示，当超声时间40min时EAE提取物得率达到最大值。超声波可促进物料分子振动加剧，增大组织的破碎程度，使有效成分溶出增加。当超声时间超过40min时，得率缓慢下降。最终选择40min作为最佳提取时间。

图3 灰树花不同溶剂提取物对胰脂肪酶活性的抑制率Fig.3 Inhibitory rates of pancreatic lipase by extracts from Grifola frondosa with different solvent

图4 料液比对灰树花EAE提取物得率的影响Fig.4 Influence of liquid-to-solid ratio on the yield of EAE from Grifola frondosa

2.4.3 提取温度的选择 如图6所示，在一定温度范围，得率随着浸提温度的升高而增加，在温度为40℃时得率达到最高值。浸提温度的升高有助于加快活性成分的布朗运动，有利于活性成分在提取溶剂中的溶出。因本试验所用提取溶剂为乙酸乙酯，温度过高溶剂易挥发而损失，故得率下降。最终选择40℃为最适宜的浸提温度。

图5 超声时间对EAE提取物得率的影响Fig.5 Influence of ultrasound time on the yield of EAE from Grifola frondosa

图6 提取温度对EAE提取物得率的影响Fig.6 Influence of extraction temperature on the yield of EAE from Grifola frondosa

2.5 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的提取工艺的响应面优化分析

2.5.1 响应面试验设计及结果 依据2.4节单因素试验结果，根据表1的因素水平表对灰树花EAE提取进行响应面优化设计。以提取物的提取率（%）为响应值，采用Box-Benhnken中心组合，对料液比、超声时间、提取温度3个因素，做三因素三水平优化设计试验。利用Design Expert8.0软件对表3试验结果做回归分析，拟合模型后得到灰树花EAE提取得率（Y）对料液比（A）、超声时间（B）、提取温度（C）的多元二次回归方程：

Y=0.43+0.024A-0.029B+0.011C-0.012AB+0.023AC+0.019BC-0.037A2-0.00565B2+0.098C2

对回归模型进行方差分析和系数显著性检验，结果见表4。灰树花EAE得率响应面模型的F值为18.27，P＜0.01差异极显著；失拟项的F值为5.38，P=0.0689＞0.05，差异不显著，这说明该模型的拟合性较好，数据没有异常点，可忽略由不确定因素所带来的影响。模型的决定系数R2=0.9592，说明提取率的变化有95.92%来源于所选3个变量。该模型中一次项中A、B对该模型的影响达到极显著（P＜0.01）水平，C对该模型的影响不显著。

从显著性来看，对响应值（即提取率）的影响因素的主次顺序为B＞A＞C，即超声时间＞料液比＞提取温度。经响应面模拟的回归模型优化，获得最优提取条件：液料比29.03∶1（mL/g），超声时间30 min，浸提温度50℃。在该条件下灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的理论得率为0.568%。

表3 响应面优化设计结果Table3 Experiment results of Box-Benhnken design

（续表3）

表4 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）提取得率回归模型方差分析Table4 Analysis of variance for quadric regression model of experiment of EAE from Grifola frondosa

2.5.2 交互项作用对灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）得率的影响 根据回归模型绘制响应曲面的直观3D图（图7）所示：以曲面坡度的平缓和陡峭程度作为因素对提取物得率的响应灵敏度反映指标。从图7和表4可以可看出，3个因素的交互作用都不显著，说明没有交互作用。

图7 各交互因素对灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）得率的响应面3D图Fig.7 3D modle graphs for the effects of interaction on the extraction ratio of EAE from Grifola frondosa

2.6 最优提取条件的验证

为了方便实际操作，将2.5节中得到的提取条件作修正，即：液料比29：1（mL/g），超声时间30min，浸提温度50℃。测得3组平行验证试验的实际得率平均值为0.565%，与理论值基本相符。后续试验中均以实际操作条件为准。具体数据见表5。

2.7 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）中组分的UPLC-QTOF-MS/MS分析鉴定结果

灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）中各组分在UPLC液相洗脱中被有效分离，各色谱峰对应的质谱结果见图8。

表5 最优提取条件验证结果Table5 The verification results in the optimal extraction conditions

图8 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的UPLC-QTOF-MS总离子流色谱图Fig.8 The UPLC-QTOF-MS chromatograms of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa

图9 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）组分的质谱鉴定Fig.9 The mass spectrum of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa

根据各色谱峰所对应的质谱信息进行比对分析，主要对比其分子质量信息，通过Phenol-Explorer多酚数据库（http：//phenol-explorer.eu/）及文献信息进行化合物的定性分析，可初步判断灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）中的主要成分是：野靛黄素（Pseudobaptigenin）[http：//phenol-explorer.eu/metabolites/882]、矢车菊素-3-O-芸香糖苷（Cyanidin 3-O-xylosyl-rutinoside）[http：//phenol-explorer.eu/compounds/62]。其中，野靛黄素属于异黄酮类是灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）中最主要的成分，矢车菊素-3-O-芸香糖苷属于花青苷类。对于其它5个峰未在Phenol-Explorer多酚数据库中匹配上，可能是这5个物质不属于多酚类化合物。

表6 灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）的UPLC-TOF-MS鉴定结果Table6 The identification results of ethyl acetate extract（EAE）of Grifola frondosa by UPLC-TOF-MS

3 结论

本研究共提取到11种灰树花提取物，利用模拟胆汁胶束法、脂肪酶抑制进行体外筛选，结果表明：灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）对脱氧胆酸钠和胆酸钠的结合能力是最高的，其中对脱氧胆酸钠的吸附量为24.59μmol/100mg，对胆酸钠的吸附量为22.19μmol/100mg；灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）对胰脂肪酶的抑制活性最高（达73.15%），仅次于阳性药物奥利司他。

灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）活性组分的提取率较低。本研究通过单因素和响应面优化试验，确定了灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）活性组分的最佳提取工艺条件：液料比29∶1（mL/g），超声时间30min，浸提温度50℃。在此条件下做3组平行试验验证，得到3组实际得率的平均值为0.565%。

对灰树花乙酸乙酯提取物（EAE）活性组分的LC-MS/MS鉴定结果：其主要成分是野靛黄素（Pseudobaptigenin）和矢车菊素-3-O-芸香糖苷（Cyanidin 3-O-xylosyl-rutinoside）。其中，野靛黄素属于异黄酮类，矢车菊素-3-O-芸香糖苷属于花青苷类。其它5个色谱峰未在Phenol-Explorer多酚数据库中匹配上，可能是这5个物质不属于多酚类化合物。后续研究还有待采用其它化合物数据库或核磁共振（NMR）等进行鉴定。