黄芪黄酮含量测定实验适用于职业院校生物学实验教学的探究*

颜珊珊 邵亚洲 梁俊玉

（西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070）

职业院校是我国人才培养的重要组成部分，以培养符合社会经济发展需要的专业技能人才为己任。目前，我国处于经济上升时期，需要大批具有创新、创业能力的人才，这就要求职业院校在人才培养过程中要将创新、实践实训能力和应用能力等作为培养的主要目标［1］。实验教学是职业院校生物学教学的重要环节,学生可通过实验亲身操作、主动发现，从而寻求自身的主动发展，提高实验操作技能和促进思维的多向发展［2］。

黄芪为豆科多年生草本植物膜荚黄芪［As tragalus membranaceus（Fisch.Bge.）和蒙古黄芪(Astragalus membraneceus（Fisch.Bge.）var.monghlicus（Bge.） Hsiao］的干燥根，具有补气升阳、益卫固表之功效，古有“补药之长”之称。黄酮类物质作为中药黄芪的主要有效成分。近年来，对黄芪黄酮类物质的研究主要集中在抗辐射损伤、清除氧自由基、调控离子通道蛋白、增强免疫、抗病毒等方面；对于细胞保护、心律失常性疾病、感染性疾病有很好的应用前景［3］。目前实验室对黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的测定方法主要包括红外光谱法、薄层色谱法、高效液相色谱法。本次教学主要以甘肃省陇西县本地黄芪为原材料,将黄芪黄酮类毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定实验作为职业院校生物学实验的内容进行尝试,证实黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定在实验教学中的各环节均具有可控性,学生可顺利完成实验并得到较好的实验结果，利于实验课堂教学目标的有效达成。

1 黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的实验教学设计

1.1 教学目标

1）知识目标：①通过收集与查阅相关资料，对中草药黄芪和黄酮类物质的药用价值产生浓厚的学习兴趣，并认识到黄酮类物质的研究价值。②掌握黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定的基本步骤，明确实验过程中的关键环节和注意事项。

2）能力目标：①学会高效液相色谱（HPLCELSD）、旋转蒸发仪等实验设备的使用及注意事项。②学会组装回流装置，并能说出搭建回流装置的原理。③能独自制作黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的标准曲线,计算黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。

3）情感态度与价值观目标：认识到中草药黄芪和黄酮类物质的药用价值及研究前景,加深对中药材的学习兴趣。

1.2 实验教学活动组织 实验前，学生主动收集并查阅中药材黄芪和黄酮类物质的相关资料，教师制定实验方案并对全班进行分组,采用小组合作进行实验教学。学生对实验基本步骤有了初步了解。实验教学活动中，每组成员必须全部参与到活动中，亲自操作，互学互助。教师在旁引导，启发学生思考，主动发现、解决问题。实验教学活动结束后，各组汇报实验结果，进行小组讨论，思考实验过程中的注意事项与易错环节，合作交流，共同进步，最后教师进行总结。

1.3 实验教学安排

1.3.1 材料与仪器

1）试剂与仪器。①试剂：黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（纯度为95%）、色谱纯乙腈和甲醇、分析纯甲醇、超纯水、0.2%甲酸溶液。②仪器：4 号筛子、圆底烧瓶、冷凝管、25 mL 大肚移液管、高效液相色谱仪、旋转蒸发仪、水浴锅、粉碎机。

2）材料准备。选用甘肃省陇西县黄芪，依据黄芪根部的大小，分为粗、细及混合样品。取适量黄芪，置于50℃的恒温烘箱中，除去水分（直至烘干前后质量相差不到0.1 g）。用粉碎机将黄芪粉碎，过4 号筛子，备用。

1.3.2 实验操作步骤与流程［4］

1）色谱条件与系统适用性实验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱乙腈为流动相A，0.2%甲酸溶液为流动相B。按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为260 nm，紫外检测器检测。

表1 黄芪黄酮中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定

2）对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每l mL 含50 μg 的溶液，即得。

3）供试品溶液的制备：取本品粉末（过4 号筛）约l g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量。加热回流4 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量。摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

4）测定法：分别精密吸取对照品溶液，供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪。

5）标准曲线的制备：分别精密量取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品贮备液适量,用分析纯甲醇制备成系列浓度梯度,按照上述色谱条件分别进样20 μL，测定。以峰面积值（y）为纵坐标，对照品浓度（x）为横坐标绘制标准曲线。黄芪黄酮中毛蕊异黄酮葡萄糖苷回归方程为：y=0.9159x-3.3246（R2=0.999）。

1.4 实验结果与分析

1.4.1 实验结果 黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定对实验室操作规范程度并不苛刻,只要学生按照教师的要求严格操作,一般都能得到较好的实验结果。

本次实验中，全班共24 人，分成3 组。3 个小组分别根据黄芪根部大小进行实验，即分别以黄芪粗、细和混合样品为材料，测其毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量。3 个小组都得到了较好的实验结果（图1），1 组选择以黄芪粗粉为原材料，上样后发现黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷出峰时间为6.5 min 左右，色谱峰分离效果明显，无平峰，皆为单峰且峰型尖锐，呈对称状。该HPLC 图谱说明整个实验流程中未出现杂质干扰，学生实验操作得当。同时，实验发现无论黄芪根部粗细如何,其毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量皆在0.07%左右，且细粉中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量略低于黄芪粗粉和混合粉（表2），说明黄芪根部粗细对毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的测定结果影响不大,即最终实验结果显示甘肃陇西县本地黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量为0.073%。

图1 甘肃陇西县本地黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷的HPLC 图

表2 甘肃陇西县本地黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量

1.4.2 实验注意事项

1)毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液必须在48 h内使用，遵守现配现用原则。

2）涉及到“精密称定”“精密量取”字样时，要分别使用精确到4 位数的电子天平和大肚移液管。

3）在供试剂准备过程中，实验保留续虑液，这里的“续滤液”指的是液体过滤时，开始滤过的部分液体选择弃去，余下滤液称为续滤液。

2 实验教学活动总结与反思

职业院校以培养技术技能人才为己任,着重培养学生操作动手能力。对此，教师应选择合理的教学方式，因材施教，采用多种方式激发学生学习兴趣。

1）贯彻“以学生为主体，教师引导”的教学方式，进行启发式教学。实验教学过程中，教师要始终将学生放在主体地位，让学生自主交流，自主思考，主动发现问题，思考解决问题的办法。教师在旁观察学生，在恰当时刻引导学生，启发学生，而非对学生进行“填鸭式”教学，禁锢学生思维的多向发展。

2）采用合作学习教学策略，培养学生发现问题、分析问题、解决问题能力。黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷测定实验简单，操作少，但同样离不开小组成员的相互合作，例如黄芪样品的制备，高效液相流动相的配制等需要小组成员的分工合作。同时，教师要鼓励小组成员全体参与到实验中，体验参与实验的乐趣。在合作学习过程中，小组成员积极思考，亲自操作，主动发现问题，共同思考解决问题的方式。

3）采取实验室教学，培养学生生物科学素养。在实验教学过程中,学生可直接观察中药材黄芪的形态特征，认识到黄芪的研究价值，明确实验教学的教学目标与小组任务。同时，采取实验教学的方式，学生可在活动中亲身实践，锻炼自身实验操作能力，培养生物科学素养。