葡萄渣和尿素处理稻草对牛瘤胃体外发酵及消化率的影响

张世卫，何孟莲，张兴国

目前，人们对天然产品作为饲料添加剂来解决动物营养和畜牧生产中的问题产生了浓厚兴趣。使用含有次生化合物的热带植物和农业副产品，如浓缩单宁和皂苷，通过提高饲料能源利用效率，抑制瘤胃甲烷生产，从而改善瘤胃发酵（杨志刚和陈阿琴，2007）。有研究报道含有植物及其提取物的单宁和皂苷似乎可以通过降低瘤胃纤毛原虫和产甲烷菌的溶菌活性来抑制甲烷释放（Chanthakhoun等，2011）。葡萄渣是含有次生代谢物的农业副产品之一，是世界许多地区大量生产高单宁酸饲料副产品。葡萄渣通常被当作废弃物丢弃，任其腐烂，因此，在许多地区造成严重的环境污染和处理问题。但这些废弃物在反刍动物日粮中的潜在用途有助于缓解饲料原料短缺，同时也可以提高牛奶和肉类产量（Besharati和Taghizadeh，2009）。此外，葡萄渣可以作为动物饲料中纤维和多酚的来源，由于其低成本和可用性，在许多国家季节性利用在动物饲料中比较常见。Bahrami等（2010）研究了不同水平葡萄渣对雄性羊羔的影响发现，在饲粮中添加5%～10%的葡萄渣后，与对照组相比，饲料转化率显著提高。葡萄渣含有浓缩单宁，可以改变氮代谢。Shibata和Terada（2010）报道了提高反刍动物生产效率的策略，即在粗饲料中添加化学物质，如尿素、甲醛、甲酸和莫能菌素，这些物质可以提高反刍动物的营养效率、消化率，影响甲烷生成。但在体外研究中，以葡萄渣作为辅料，添加浓缩单宁和皂苷对瘤胃发酵特性和消化率的影响数据还比较有限。因此，本研究的目的是利用体外培养技术评估葡萄渣和水稻秸秆来源对瘤胃体外发酵气体动力学、发酵特性、营养物质消化率和微生物种群的影响。

1 材料与方法

1.1 试验处理与设计 采用完全随机试验设计，试验因素为2×4阶乘，即2种类型的水稻秸秆（3% 尿素处理和未处理），4种（0、2、4、6%）葡萄渣添加水平。水稻秸秆、尿素处理后的水稻秸秆、葡萄渣样品在65℃烘干72 h后，粉碎过1 mm分析筛，用于分析常规营养成分、浓缩单宁及皂苷含量。

1.2 瘤胃接种 以2头含有瘤胃瘘管的肉牛作为瘤胃液采集体，其活重（400±30）kg。肉牛被单独圈养，提供干净的淡水和盐块舔饲。水稻秸秆作为粗饲料自己采食，浓缩料由70%木薯、6%米糠、17%豆粕、1%硫酸钠、4%尿素、1%盐以及1%预混料构成。在收集瘤胃液前对肉牛饲喂20 d。每天早上饲喂前从瘤胃瘘管提取1000 mL瘤胃液，混合后用4层纱布过滤到预先加热的保温瓶中。

1.3 体外发酵 将0.2 g底物样品放入50 mL血清瓶中，分别进行相应处理。每处理5个重复，40个样品瓶加5个空白。45个瓶子在11个不同的孵育时间下孵育。孵育30 min后将瓶子轻轻混合，每3小时混合3次。样品采集程序如表1所示，分别进行氨氮和挥发性脂肪酸分析。制备24瓶样品（3瓶/处理×8处理×1采样时间，孵育4 h），进行细菌、原生动物和真菌的计数。

表1 体外瘤胃液取样程序

1.4 统计分析 采用SAS软件PROC GLM中的一般线性模型，将所有数据按2×4的阶乘排列进行统计分析。统计模型包括秸秆原料、葡萄渣添加水平和两者交互作用。用正交多项式分析了葡萄渣添加水平的变化趋势。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著，P＜0.10为有显著差异趋势。

2 结果与分析

2.1 原料养分分析 表2可知，水稻秸秆和3%尿素处理的秸秆粗蛋白质含量分别是3%和5.8%，而葡萄渣粗蛋白质含量为12.8%。此外，葡萄渣中浓缩单宁和总皂苷含量分别是12.3%和14.6%。

表2 试验用原料成分分析 %

2.2 体外发酵产气量、气体动力学参数、体外干物质消化率 秸秆原料的气体动力学在立即溶出率（a）、不溶出率（b）和产气潜力（a + b）方面差异显著（P＜0.05），且葡萄渣组有最低趋势（P=0.08）。本研究得到的产气速率（c）的变化不受秸秆原料和葡萄渣添加水平的影响（P＞0.05）。秸秆原料对累积产气量（96 h）具有显著影响（P＜0.05），当日粮中葡萄渣添加水平从2%增加到6%时，累积产气量有下降趋势（P=0.08）。如表3所示，体外干物质消化率随葡萄渣添加水平的升高表现为显著线性升高（P＜0.05），其中尿素处理秸秆+2%葡萄渣孵育24 h体外干物质消化率最高（P＜0.05），同时孵育48 h较其他组有升高趋势（P=0.08）。此外，秸秆类型与葡萄水平的交互作用显著影响微生物量，随着葡萄渣添加水平的增加，微生物量增加，其中尿素处理秸秆+2%葡萄渣显著提高微生物量（P＜0.05）。

2.3 葡萄渣和秸秆原料对瘤胃体外发酵指标的影响 由表4可知，秸秆原料与葡萄渣添加水平对挥发性脂肪酸总量、挥发性脂肪酸占比和甲烷产量的影响具有显著交互作用（P＜0.05）。添加葡萄渣和秸秆原料对挥发性脂肪酸总浓度、丙酸和乙酸与丙酸比值具有显著影响（P＜0.05），但对丁酸和乙酸浓度无显著影响（P＞0.05）。随着葡萄渣添加水平的升高，挥发性脂肪酸总浓度和丙酸浓度显著升高，但乙酸与丙酸比值显著降低（P＜0.05）。此外，甲烷产量受秸秆原料和葡萄渣添加量显著影响，其中随着葡萄渣添加量的增加，甲烷产量显著下降（P＜0.05）。秸秆原料（尿素处理或未处理）对氨氮浓度具有显著影响，添加葡萄渣后氨氮浓度有降低趋势（P=0.08），其中尿素处理秸秆组氨氮浓度显著提高（P＜0.05）。

表3 葡萄渣和秸秆原料对瘤胃液气相动力学、体外干物质消化率的影响

表4 葡萄渣和粗饲料原料对瘤胃体外发酵挥发性脂肪酸、甲烷、氨氮及pH的影响

2.4 葡萄渣和秸秆原料对瘤胃体外发酵微生物含量的影响 由表5可知，尿素处理对细菌数量有显著影响（P＜0.05），添加葡萄渣后有提高趋势（P=0.09）。原生动物数量受到秸秆来源和葡萄渣添加水平增加而线性降低（P＜0.05）。尿素处理秸秆较未处理组显著提高真菌数量（P＜ 0.05）。

表5 葡萄渣和粗饲料原料对瘤胃体外发酵微生物含量的影响

3 讨论

Raghuvansi（2007）研究发现，瘤胃体外气生产的速率与本试验结果相似，而秸秆来源和葡萄渣添加水平对气体动力学的速率（c）无显著影响。当日粮中葡萄渣添加水平从2%提高至6%时，累积产气量有下降趋势。据报道，单宁可以降低累积气体产量，因为单宁-大分子复合物的形成抑制了微生物酶和瘤胃厌氧菌对营养物质的利用（Makkar，2003）。El-Waziry等（2005）也得到类似结果，他们发现在豆粕中添加单宁酸会降低气体产量，单宁的添加增加了发酵延迟时间，可能是由于抑制了微生物的酶活性（Bach等，2005）。甲烷产量受秸秆原料和葡萄渣添加量显著影响，其中随着葡萄渣添加量的增加，甲烷产量显著下降，这与Makkar（2003）的研究结果一致，其研究结果发现，低浓度单宁改变了瘤胃发酵。但单宁也可能通过形成单宁蛋白复合物而对蛋白质的消化率产生负面影响，同时单宁蛋白复合物也可以调节蛋白质水解活性。

本研究结果发现，随着葡萄渣添加水平的升高，挥发性脂肪酸总浓度和丙酸浓度升高，乙酸与丙酸比值降低。Chanthakhoun等（2011）报道，在水牛日粮中，以600 g/头/d的采食量补充牛眼草（含2.8%浓缩单宁）可以提高丙酸产量。Tavendale等（2005）提出浓缩单宁降低反刍动物甲烷排放的两种机制，（1）通过减少纤维消化间接减少氢气的产生；（2）通过抑制产甲烷菌的生长。通过尿素处理水稻秸秆和含单宁的葡萄糖补充来控制瘤胃发酵，可以维持较高的瘤胃pH、适宜的氨氮浓度，增加微生物蛋白合成和必需挥发性脂肪浓度来提高瘤胃发酵效率，进而提高反刍动物生产力。此外，随着葡萄渣添加水平的增加，氨氮浓度降低，表明添加含单宁的葡萄渣可能降低蛋白质水解、多肽降解和氨基酸脱氨，这与El-Waziry等（2005）的研究一致。

补充葡萄渣对细菌种群有一定影响，同样，Anantasook和 Wanapat（2012）的研究结果也发现，添加4%浓缩单宁可以增加纤维素分解菌数量。本研究结果发现，秸秆来源和葡萄渣添加水平降低了原生动物的数量，与Bhatta等（2009）等的体外研究结果一致，其报道单宁通过减少原生动物数量来抑制甲烷生成。相比之下，Raghuvansi等（2007）报道，用含单宁酸的饲料饲养绵羊，其瘤胃中原生动物总数无显著变化，作者推断这种差异可能是由于日粮类型、动物品种、个体差异和抽样方法的差异造成的。

4 结论

在本试验条件下用3%尿素处理水稻秸秆，再添加2%葡萄渣可以改善体外气体动力学、消化率、丙酸、挥发性脂肪酸总量浓度和细菌数量，同时降低乙酸与丙酸比例、原生动物数量和甲烷产量，结果揭示了葡萄渣可以提高瘤胃发酵的潜力，并有可能提高反刍动物的生产效率。