紫杉醇联合二甲双胍对人乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用的研究

祁冰洁，严其高2，刘慧娟，刘婷婷，祝凌丽，任煜

(1. 安庆医药高等专科学校药学系，安徽 安庆 246052；2. 安庆医药高等专科学校教务处，安徽 安庆 246052)

研究发现[1]，90%以上肿瘤患者的死亡都不同程度地与抗肿瘤药物的多药耐药有关，但具体发生机制尚未完全清楚。紫杉醇是一种可以抑制多种肿瘤的一线肿瘤化疗药物，可以通过抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭过程，发挥杀伤癌细胞的作用，但在临床应用过程中耐药情况经常发生，这也是导致肿瘤细胞发生转移，癌症预后较差的主要原因之一[2]。二甲双胍的抗肿瘤效果首次发现在糖尿病的临床治疗中，后续的研究发现[3]，二甲双胍不仅可以有效治疗糖尿病，还可以降低糖尿病患者发生肿瘤的风险。有研究发现[4]，患有糖尿病的癌症患者在化疗期间联用二甲双胍，缓解率明显升高。实验动物学的相关研究也发现[5]，二甲双胍能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本研究将二甲双胍联合紫杉醇用于对人乳腺癌细胞MCF-7的生物学行为的研究中，旨在为乳腺癌的临床治疗方案的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1材料 人乳腺癌细胞系MCF-7购于中国科学院细胞库(上海)。MEM培养基、胎牛血清均购于HyClone公司；紫杉醇、二甲双胍购于Sigma公司；结晶紫购于南京凯基试剂有限公司；Transwell小室购于美国Corning公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 以含10%胎牛血清的培养基在37℃、5%的CO2的培养箱中常规培养人乳腺癌细胞系(MCF-7)，再用2.5%的胰蛋白酶每2 d进行消化及传代，取对数增殖期细胞用于实验。MCF-7细胞：取对数增殖期细胞(1～1.5)×106个分板，接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养至细胞汇合度为60%～70%，再将细胞分为3组：对照组、紫杉醇组、联合组。

1.2.2CCK-8实验 收集对数期的MCF-7细胞，离心后弃去上清，加入适量10%培养基，吹打混匀。取20 μl单细胞悬液置于500 μl EP管中，加入60 μl台盼蓝，吹打混匀后进行计数。以3×103～5×103个细胞/毫升接种于96孔培养板，每孔培养基100 μl，培养12 h后，将不同浓度梯度的二甲双胍、紫杉醇分别加入二甲双胍组、紫杉醇组，每孔加入含CCK的培养基，1～4 h后检测OD值，计算二甲双胍和紫杉醇的IC50。之后选择适宜浓度的二甲双胍、紫杉醇按照不同处理时间进行CCK-8实验。分别观察不同浓度梯度的二甲双胍、紫杉醇对MCF-7细胞生长抑制率的作用，以及相应的药物不同处理时间对MCF-7细胞生长抑制率的作用。实验重复进行3次。前期预实验中，分别观察了10 μmol/L、100 μmol/L浓度二甲双胍及紫杉醇浓度对乳腺癌细胞的生物学作用，因此本文中在10～100 μmol/L浓度之间设置了二甲双胍及紫杉醇的浓度梯度。

1.2.3划痕实验 将不同分组加入药物后的MCF-7细胞接种于12孔板中，待细胞长满后，用移液枪头垂直于12孔板，每孔划2～3条平行线。培养后倒置显微镜下拍照观察细胞迁移情况，使用Image-Pro Plus软件检测细胞迁移距离。实验重复进行3次。

1.2.4Transwell实验 迁移实验：将不同分组加入药物后的MCF-7细胞进行消化离心，计数，24孔板内加入MEM培养基，Transwell小室内加入无血清细胞悬液，培养12 h后观察穿过小室的细胞数量，甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下拍照计数。实验重复进行3次。侵袭实验：将Transwell小室用基质包被，在按照迁移实验的方法进行实验。实验重复进行3次。

2 结果

2.1CCK-8实验检测不同药物浓度作用下的MCF-7细胞生长抑制率 在药物作用时间均为12 h的情况下，紫杉醇组伴随药物浓度的增加，MCF-7细胞生长抑制率呈显著升高趋势(F=-23.236，P<0.001)；联合组在紫杉醇药物浓度为20 μmol/L的条件下，伴随二甲双胍浓度的增加，MCF-7细胞生长抑制率呈显著升高趋势(F=-20.036，P<0.001)。紫杉醇组、联合组不同药物浓度亚组的细胞生长抑制率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。联合组不同药物浓度亚组的细胞生长抑制率均明显高于20 μmol/L紫杉醇组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。

表1 不同浓度药物作用下的MCF-7细胞生长抑制率比较

图1 不同浓度药物作用下MCF-7细胞生长抑制率

2.2CCK-8实验检测不同药物作用时间对MCF-7细胞生长抑制率的影响 在相同药物浓度的情况下，紫杉醇组伴随药物作用时间的增加，MCF-7细胞生长抑制率呈显著升高趋势(F=-32.114，P<0.001)；联合组在伴随药物作用时间的增加，MCF-7细胞生长抑制率呈显著升高趋势(F=-30.477，P<0.001)。紫杉醇组、联合组不同药物作用时间亚组的细胞生长抑制率均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。联合组不同药物作用时间亚组的细胞生长抑制率均明显高于20 μmol/L紫杉醇组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。

表2 不同药物作用时间的MCF-7细胞生长抑制率比较

图2 不同药物作用时间的MCF-7细胞生长抑制率

2.3划痕实验检测乳腺癌细胞迁移距离 划痕实验检测结果显示，在不同作用时间的情况下，3组间乳腺癌细胞MCF-7的迁移距离存在统计学差异(P<0.05)。紫杉醇组、联合组分别在药物浓度为20 μmol/L紫杉醇、20 μmol/L二甲双胍+20 μmol/L紫杉醇的条件下，作用24 h、48 h时的细胞迁移距离均明显少于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。联合组在作用24 h、48 h时的细胞迁移距离均明显少于紫杉醇组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。

表3不同药物作用时间的MCF-7细胞迁移距离单位：μm

组别n细胞迁移距离24 h48 h对照组334.34±3.4643.65±4.35紫杉醇组312.56±1.26a12.31±1.21a联合组36.85±0.71ab4.47±0.47abF26.23632.321P<0.001<0.001

图3 划痕实验检测MCF-7迁移情况

2.4Transwell实验检测乳腺癌细胞迁移、侵袭情况 紫杉醇组、联合组分别在药物浓度为20 μmol/L紫杉醇、20 μmol/L二甲双胍+20 μmol/L紫杉醇的条件下，作用12 h后，3组间穿过小室膜和基底膜的细胞数量差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析结果显示，紫杉醇组和联合组穿过小室膜和基底膜的细胞数量均明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。联合组穿过小室膜和基底膜的细胞数量均明显低于紫杉醇组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。

表4不同组别MCF-7细胞迁移、侵袭数量比较单位：个

组别n穿过小室膜的细胞数量穿过基底膜的细胞数量对照组3115.6±11.598.5±9.8紫杉醇组348.6±4.8a44.2±4.4a联合组325.6±2.5ab26.6±2.6abF29.56537.455P<0.001<0.001

图4 Transwell实验检测MCF-7迁移、侵袭情况

3 讨论

乳腺癌为临床常见的恶性肿瘤，进展期可出现癌细胞的侵袭和转移能力明显增强、上皮间质转化、肿瘤异质性等改变，导致癌细胞对抗癌药物的敏感性降低[6]。紫杉醇在乳腺癌的治疗中能够明显抑制乳腺癌细胞的生物学活性，但也可能由于多药耐药的发生导致化疗失败[7]。因此，如何提高抗癌药物治疗乳腺癌的效果，降低癌细胞对化疗药物的耐药性，增加癌细胞对药物的敏感性是学者们面临的重要课题。研究发现，二甲双胍可通过调节糖脂代谢、血浆黏度、血中炎性因子等机制影响多种疾病的发生发展，还可增强多种肿瘤对化疗药物的敏感性，如子宫内膜癌、上皮性卵巢癌、结直肠癌、宫颈癌等[8-12]。本研究将二甲双胍联合紫杉醇应用于人乳腺癌细胞的相关研究中，探索两种药物相结合的情况下，MCF-7细胞的生物学活性。

CCK-8实验检测了不同药物浓度及作用时间下MCF-7细胞生长抑制率的作用情况。首先将不同浓度的紫杉醇作用于MCF-7细胞，在相同的作用时间下，紫杉醇的药物浓度越高，MCF-7细胞生长抑制率越高，说明紫杉醇能够明显抑制MCF-7细胞的生长。联合组分别将不同浓度的二甲双胍与紫杉醇进行联合使用，共同作用于MCF-7细胞，结果发现，伴随二甲双胍浓度的增加，MCF-7细胞生长抑制率呈明显升高趋势。说明二甲双胍联合紫杉醇对MCF-7细胞的生长同样具有明显的抑制作用。进一步分析发现，联合组对MCF-7细胞的生长抑制率均明显高于紫杉醇组，说明紫杉醇与二甲双胍联合使用增加了药物对乳腺癌细胞生长的抑制作用。不同药物作用时间下MCF-7细胞生长抑制率的研究结果也提示，伴随药物作用时间的延长，紫杉醇组、联合组的细胞生长抑制率均呈显著升高趋势，说明乳腺癌细胞的生长对药物具有时间依赖性。在相同的作用时间条件下，联合二甲双胍的联合组对MCF-7细胞的生长抑制率均明显高于紫杉醇组。进一步证实了二甲双胍联合紫杉醇能够增强药物对乳腺癌细胞的生长抑制作用。

划痕实验检测结果发现，紫杉醇组、联合组在药物作用一定时间的情况下，MCF-7细胞的迁移距离明显短于对照组，说明药物限制了乳腺癌细胞的迁移。进一步分析结果发现，联合组的MCF-7细胞的迁移距离明显短于紫杉醇组，说明二甲双胍联合紫杉醇对乳腺癌细胞迁移的限制作用强于紫杉醇。Transwell实验对乳腺癌细胞迁移、侵袭情况的检测结果同样显示，经过紫杉醇或联合二甲双胍处理过的乳腺癌细胞，穿过Transwell小室膜和基底膜的细胞数量明显少于对照组，说明药物能够抑制乳腺癌细胞的侵袭和迁移。联合组穿过小室膜和基底膜的MCF-7细胞数量明显少于紫杉醇组，说明二甲双胍联合紫杉醇作用于乳腺癌细胞后，抑制其侵袭和迁移的作用明显强于紫杉醇组。

综上所述，本研究结果证实二甲双胍能够加强紫杉醇对乳腺癌细胞的生长、迁移、侵袭的抑制作用，这为临床治疗乳腺癌的策略提供了参考。在今后的研究中，将探讨不同的乳腺癌细胞系对二甲双胍的敏感性，以及二甲双胍抑制乳腺癌的机制。