基于网络药理学的栀子柏皮汤治疗肝炎作用机制研究Δ

蔡华丹，张 静，于珊珊，曹明雪，赵艳玲#

(1.中国人民解放军总医院第五医学中心药学部，北京100039； 2.北京大学人民医院药剂科，北京 100044)

栀子柏皮汤为中国传统中药中有名的复方，出自《伤寒论》，由栀子、黄柏和甘草3味药组成。黄柏苦寒，善清脏腑结热，且能泄湿退黄；以苦寒之栀子清泄三焦而通调水道，使湿热从小便而出[1]；甘草甘平和中，防栀子、黄柏苦寒伤胃；三药配伍，达到以清泄里热为主，兼以祛湿的功效。现代药理研究结果表明，栀子具有解热、保肝利胆和抗菌消炎等作用，黄柏具有保肝和增强免疫功能等作用，甘草具有保肝、降脂和抗炎等作用[2]。但目前，对栀子柏皮汤治疗急、慢性肝病的研究相对较少。网络药理学作为新兴的技术方法，可以对中药作用于机体后的多成分、多途径和多靶点进行较为全面地揭示。故本研究拟应用网络药理学分析方法，分析、预测栀子柏皮汤治疗肝炎的作用机制，进一步分析其作为肝病治疗用药的合理性及针对性，以期为后续实验研究及为临床用药提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 栀子柏皮汤药物靶点筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)获得栀子柏皮汤所含的化学成分结构，再依据相似性比对中草药活性成分数据库(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http://lifecenter.sgst.cn/hit/)[3]和治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http://bidd.Nus.edu.sg/group/cjttd/)[4]进行靶点筛选，建立栀子柏皮汤中药物靶点数据集。

1.2 慢性肝炎相关疾病靶点筛选

通过人类孟德尔遗传综合数据库(online Mendelian inheri-tance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)[5]搜集肝炎相关的疾病靶点；其他人类交互蛋白靶点通过交互蛋白数据库(database of interacting protein，DIP)(http://dip.doe-mbi.ucla.edu)获得；将以上靶点转化为UniProt数据库识别码形式。

1.3 “成分-靶点-疾病”网络的构建及分析

将搜集到的栀子柏皮汤3味药中的化合物成分、药物作用靶点和疾病作用靶点通过蛋白质-蛋白质相互作用数据库(protein-protein interaction，PPI)进行分析，将分析出来的结果导入Cytoscape 3.7.1软件中进行可视化并进行各靶点的相关参数分析。有效作用靶点用点度中心性、中介中心性和接近中心性3个拓扑参数进行筛选；同时，将点度中心性≥2倍中位数、中介中心性≥1倍中位数和接近中心性≥1倍中位数的靶点作为本研究得到的重要靶点。

1.4 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注释分析

将“1.3”项下所得直接作用靶点的UniProt数据库识别码导入功能注释工具DAVID 6.8中进行KEGG通路注释分析，得出交互网络中的直接作用靶点相关作用通路。

2 结果

2.1 药物靶点和疾病靶点数据的筛选结果

基于数据库构建方法，共筛选出栀子柏皮汤中330个化学成分和4 456个靶点蛋白。栀子柏皮汤组方各药物中，栀子化学成分68个，靶点835个；黄柏化学成分103个，靶点1 307个；甘草化学成分159个，靶点2 314个，以上获得的药物靶点被用来进一步构建“成分-靶点-疾病”网络。同时，筛选出肝炎对应的疾病靶点498个。

2.2 “成分-靶点-疾病”网络构建与分析

为了更清晰直观地阐释栀子柏皮汤治疗肝炎的复杂网络关系，本研究通过网络药理学方法构建“成分-靶点-炎症”交互网络，并进一步通过分析该网络中各靶点的拓扑参数值，筛选出较为重要的关键蛋白靶点和相关的信号通路。栀子柏皮汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络见图1。选取该图中所有直接作用靶点，并计算其拓扑参数度值、接近中心性和介数，结果见表1。栀子柏皮汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互作用网络中与直接作用靶点直接相连靶点交互网络见图2，该图进一步简化了“成分-靶点-疾病”交互网络，凸显了栀子柏皮汤治疗肝炎中化学成分的直接作用靶点的相关网络关系；该图包含了117个化学成分，11个非直接药物作用靶点，5个非直接肝炎靶点和70个交互蛋白；其中，三角形为药物/成分，箭头为药物/成分直接作用的疾病靶标，圆点为与靶标存在相互作用的蛋白质。栀子柏皮汤中化学成分与直接作用靶点的交互关系见图3，其中，箭头为药物/成分直接作用的疾病靶标，三角形为药物/成分。

图1 栀子柏皮汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of Zhizibopi decoction in the treatment of hepatitis

图2 栀子柏皮汤治疗肝炎的“成分-靶点-疾病”交互作用网络中与直接作用靶点直接相连靶点交互网络Fig 2 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of direct targets of Zhizibopi decoction in the treatment of hepatitis

表1 栀子柏皮汤治疗慢性肝炎的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点拓扑参数分析Tab 1 Topological parameter analysis of Ingredients-Target-Disease interactive network of direct targets of Zhizibopi decoction in thetreatment of hepatitis

图3 栀子柏皮汤治疗肝炎的“成分-直接作用靶点”交互网络Fig 3 “Ingredients-Direct Target” interactive network of Zhizibopi decoction in the treatment of hepatitis

2.3 KEGG通路注释分析

基于上述分析结果，筛选出13个直接作用靶点作为本次KEGG通路注释分析的参与靶点。将符合筛选条件的直接作用靶点呈递到DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路注释分析。结果显示，共筛选出24条信号通路与肝炎相关，见表2、图4。

3 讨论

中药复方是在中医药理论的指导下，依据辨证论治并按君臣佐使将药物组方、配伍后形成的复杂系统。栀子柏皮汤出自张仲景的《伤寒论》，是利湿退黄的经典方剂，经过后世医家的不断发掘与实践，该方在治疗酒精性肝炎、病毒性肝炎和免疫性肝炎等各种肝炎方面具有较好的疗效。

表2 栀子柏皮汤治疗肝炎的KEGG通路分析The 2 KEGG pathway of the action of Zhizibopi decoction in the treatment of hepatitis

图4 栀子柏皮汤治疗肝炎的KEGG通路分析Fig 4 Pathway analysis of direct targets of Zhizibopi decoction in the treatment of hepatitis

网络药理学是基于网络数据库，通过计算机方法整合大量生物学信息来分析、预测不同节点之间关联性的综合学科[6]。其优势在于可从蛋白、分子和基因等多层面，通过图形理论、数据挖掘以及信息可视化等方法，揭示药物对机体的作用及其机制，使研究具有靶向性。中药具有多成分、多靶点的特征，而网络药理学这种多靶点、多途径和多层次的评价方法在中药的研究中有较好的预测作用，更加切合中医药的学术特点和实际，为解决现代中药研究的热点问题发挥了巨大的作用[7-8]。

查阅文献并结合本研究结果可见，栀子柏皮汤可以通过肿瘤坏死因子信号通路、Jak-STAT信号通路和T细胞受体信号通路等通路干预机体炎症反应和调节机体免疫，发挥抗炎作用。本研究采用网络药理学方法，初步揭示了栀子柏皮汤治疗肝炎的科学内涵，为中药的研究方法提供了新思路。