基于网络药理学的吴茱萸抗胃癌潜在有效成分及作用机制研究Δ

韦 颖，王 建，任思陈，杨玉雪,2，王 丹,2，文建霞,2，谢 倩，魏士长,2，赵艳玲

(1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.中国人民解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039)

胃癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，西医治疗以外科手术为主，结合辅助放化疗等综合措施，但存在明显不良反应[1]。胃癌在中医学中可归属于“反胃”“积聚”“伏梁”及“胃脘痛”等范畴，具有不同证型[2]。文献报道，胃癌的证型多为肝胃不和证[3]。辨证分型论治是现代中医治疗胃癌的有效手段[4]。中医药治疗协同化疗能够提高患者的生活质量，抗肿瘤作用显著[5]。吴茱萸始载于《神农本草经》，具有温中止痛、止呕和止泄的功效，适用于胃脘痛、呕吐吞酸等，古代医家常用吴茱萸配伍不同中药治疗胃肠道疾病[6-8]。现代研究结果显示，吴茱萸具有抗肿瘤、降血脂、抗炎镇痛和抑制溃疡等药理作用。鉴于胃癌的中医范畴及证型，结合吴茱萸的古今应用及相关抗胃癌报道[9-10]，本研究拟通过网络药理学方法探讨吴茱萸抗胃癌潜在的有效成分和作用机制，进一步分析其在治疗胃癌方面是否具有合理性及针对性，以期为后续研究及临床提供参考。

1 资料与方法

1.1 吴茱萸药物靶点筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)，获得吴茱萸所含的活性成分的化学结构；再通过中草药活性成分数据库(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http://lifecenter.sgst.cn /hit/)和治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)进行靶点筛选，建立吴茱萸药物靶点数据集[11]。

1.2 胃癌疾病靶点筛选

通过人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http://www.omim.org/)筛选胃癌相关基因和蛋白靶点，建立胃癌靶点数据集，其中靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库(database of interacting protein，DIP)(http://dip.Doe-mbi.Ucla.edu)获得[12]。为便于分析，均将上述所有靶点转化为UniProt数据库识别码格式。

1.3 “成分-靶点-疾病”交互网络的构建与分析

为进一步探索中药吴茱萸的活性成分与胃癌靶点之间的相互关系，将搜集到的上述吴茱萸化合物成分、药物作用靶点和疾病作用靶点通过蛋白质-蛋白质相互作用数据库(protein-protein interaction，PPI)进行分析，将分析结果导入Cytoscape 3.7.1软件进行可视化分析，对各靶点相关参数进行分析。

1.4 基因本体(gene ontology，GO)富集分析

为说明中药化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用，利用Cytoscape 2.8.3软件对蛋白靶点进行GO富集分析，分别从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对基因产物进行标准化描述，并绘制GO分析条目图。

1.5 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注释分析

将“1.3”项下所得的直接作用靶点的UniProt数据库识别码导入功能注释工具DAVID中进行KEGG通路注释分析，得出交互网络中的直接作用靶点相关通路。

2 结果

2.1 吴茱萸和胃癌的靶点筛选

基于数据库构建方法，本研究共筛选出31个吴茱萸化学成分和407个直接作用靶点，7个胃癌直接作用靶点和67个交互蛋白靶点，以上药物靶点被用来进一步构建“成分-靶点-疾病”网络。

2.2 网络构建和通路分析

为全面客观地揭示吴茱萸抗胃癌的可能有效成分及潜在的作用靶点，对上述数据进行网络药理学分析，构建“成分-靶点-疾病”交互网络并进行可视化分析，将吴茱萸抗胃癌的复杂网络呈现出来，并对各靶点的相关参数进一步分析，见图1—2；图1中，三角形代表吴茱萸中可能的有效活性成分，圆形代表药物与疾病的作用靶点，方形代表药物和疾病共同直接作用的靶点。经分析，共筛出3个吴茱萸治疗胃癌潜在的主要活性成分和6个直接作用靶点，见表1—2。表2中所列的直接作用靶点包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2 A、肿瘤抑制因子ARF、干扰素调节因子1、细胞肿瘤抗原p53、酪氨酸激酶受体2和白细胞介素1β，故认为上述6个蛋白是吴茱萸抗胃癌的重要潜在蛋白靶点。

图1 吴茱萸治疗胃癌的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

图2 吴茱萸治疗胃癌的“成分-靶点-疾病”直接作用交互网络Fig 2 “Ingredients-Target-Disease” interactive network of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

表1 吴茱萸治疗胃癌潜在化学成分Tab 1 Potential chemical ingredients of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

表2 吴茱萸治疗胃癌的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点的拓扑参数分析Tab 2 Topological parameter analysis of “Ingredients-Target-Disease” interactive network of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

2.3 GO分析

对相关蛋白靶点在基因功能中的作用进行研究，共得到GO分析条目23个，见图3。根据吴茱萸抗胃癌作用预测靶点的GO分析结果，对生物过程进行统计学分析并按照相关度排列，发现吴茱萸主要通过调控4种生物过程进而发挥对胃癌的治疗作用，可知相关蛋白涉及的基因功能包括“regulation of execution phase of apoptosis”(调节细胞凋亡的执行阶段)、“negative regulation of T cell differentiation”(T细胞分化的负调节)、“regulation of protein export from nucleus”(细胞核蛋白输出的调节)和“regulation of cell cycle arrest”(细胞周期停滞的调节)等方面，见图4。

图3 吴茱萸抗胃癌作用的GO分析Fig 3 GO analysis of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

图4 吴茱萸生物调节相关度分析Fig 4 Correlation analysis of biological regulation of Wuzhuyu

2.4 KEGG通路注释分析

基于上述分析结果，筛选出13个直接作用靶点作为本次KEGG通路注释分析的参与靶点。将符合筛选条件的直接作用靶点呈递到DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路注释分析。结果显示，共筛选出8条信号通路，分别为 “MicroRNAs in cancer”(恶性肿瘤中的微小RNA)、“Cell cycle”(细胞周期)、“p53 signaling pathway”(p53信号通路)、“Pathways in cancer”(恶性肿瘤通路)、“Viral carcinogenesis”(病毒致癌作用)、“Thyroid hormone signaling pathway”(甲状腺激素信号通路)和“Proteoglycans in cancer”(恶性肿瘤中的蛋白多糖)，见图5。

图5 吴茱萸治疗胃癌直接作用靶点的KEGG通路分析Fig 5 KEGG pathway analysis of direct targets of Wuzhuyu in the treatment of gastric cancer

3 讨论

本研究采用网络药理学方法，初步探索了吴茱萸治疗胃癌的可能有效成分及潜在作用机制。结果显示，筛出3个吴茱萸治疗胃癌潜在的主要活性成分，分别为“gossypetin”(棉黄素)、“Gravacridoneshlirine”和“quercetin”(槲皮素)。其中，棉黄素已被证实具有抗突变、抗氧化、抗菌和抗动脉粥样硬化作用，还可通过其自由基清除活性改善辐射诱导的氧化应激和DNA损伤，并可调控凋亡和自噬发挥抗恶性肿瘤活性[13-14]；Gravacridone-shlirine相关研究资料较少，在刘鑫馗等[15]对吴茱萸汤作用机制分析的研究中，其作为吴茱萸汤中活性成分存在，该成分更待进一步研究；大量研究结果表明，槲皮素可通过多种途径对多种肿瘤具有抗肿瘤特性[16]。查阅文献发现，许多研究结果证实了吴茱萸其他成分也具有抗恶性肿瘤活性，甚至表现出抗胃癌的作用，如吴茱萸碱、吴茱萸次碱等[9-10]。分析结果提示，仍需继续研究吴茱萸的有效成分及作用靶点，吴茱萸确实具有一定的抗胃癌潜力，可能其抗胃癌作用并不仅作用于疾病的直接靶点。

通过直接靶点和相关交互蛋白分析可见，“MicroRNAs in cancer”(恶性肿瘤中的微小RNA)、“Cell cycle”(细胞周期)、“p53 signaling pathway”(p53信号通路)、“Pathways in cancer”(恶性肿瘤通路)、“Viral carcinogenesis”(病毒致癌作用)、“Thyroid hormone signaling pathway”(甲状腺激素信号通路)和“Proteoglycans in cancer”(恶性肿瘤中的蛋白多糖)可作为吴茱萸抗癌潜在的信号通路。其中，恶性肿瘤中的微小RNA在胃癌中的研究较广，而吴茱萸调控微小RNA未见报道，有待进一步研究剖析。

总之，本研究基于吴茱萸古方配伍应用及现代药理研究，结合网络药理学，预测出吴茱萸治疗胃癌的3个可能的活性成分及6个潜在的作用靶点，初步揭示了吴茱萸治疗胃癌可能的作用网络，为吴茱萸治疗胃癌的进一步实验研究及临床应用提供了参考。