肿瘤个体化诊断PCR类检测试剂体系探讨

李耀华，李 思，塔 娜

(国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心质量管理部，北京 100000)

近年来，癌症发病率持续上升，已经成为威胁人类健康的重要疾病。手术、放疗和化疗是癌症治疗的主要方法，但手术治疗不适于已经发生转移的癌症晚期患者，放疗和化疗亦因其严重的毒副作用在临床应用中明显受限[1]。靶向治疗是通过将靶向药物作用于特定的靶分子，特异性地杀死肿瘤细胞，达到肿瘤治疗目的的一种治疗手段。其疗效好，毒副作用小，给药方式便捷，逐渐成为肿瘤治疗的主流趋势之一[2-4]。靶向药物在使用之前需要对患者特定基因进行检测，以指导药物的使用，因此，肿瘤靶向治疗也被称为个体化治疗，与之相关的基因检测称为肿瘤个体化诊断。从某种意义上说，个体化治疗的成功依赖于精确可靠的基因检测技术，安全和有效的个体化诊断试剂是实施肿瘤个体化治疗的基本条件[5]。

1 国内、外肿瘤个体化诊断试剂的注册现状

目前，已有多个肿瘤个体化诊断试剂获得国家药品监督管理局(NMPA)的批准，主要集中在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤领域。在已上市产品中，以肺癌表皮生长因子受体(EGFR)基因突变检测和乳腺癌人类表皮生长因子受体-2(HER2)基因扩增检测产品占比最大。继2010年我国首个非小细胞肺癌EGFR基因突变检测试剂上市之后，陆续有KRAS、BRAF、ALK、ROS1等单基因突变检测产品获批上市。2018年用于指导肺癌多种靶向药物治疗的多基因联合检测PCR产品和高通量测序产品也获批上市。在美国，也有多个肿瘤个体化诊断试剂盒获得美国食品药品监督管理局(FDA)的批准，所涉及的癌种包括肺癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、黑色素瘤等恶性肿瘤[6-7]，既包括单基因检测产品，如EGFR、RAS、BRAF、ALK、BCR-ABL等，也包括可以同时检测多个基因的高通量测序产品，如FoundationOne CDx、Oncomine Dx Target Test等。

与肿瘤个体化诊断相关的核酸变异主要包括点突变、插入、缺失、融合、拷贝数变异等类型。在已批准产品中，点突变、插入、缺失等基因变异检测产品大多与PCR技术相关。融合基因的检测方法包括3种，荧光原位杂交(FISH)、逆转录PCR和免疫组化法(IHC)，分别在DNA、RNA和蛋白水平进行检测，基因拷贝数变异的检测方法主要为FISH。目前，肿瘤个体化治疗需检测的基因突变靶点相对有限，而PCR方法既可以在DNA水平检测点突变、插入及缺失，又可以在RNA水平上检测基因融合，已成为我国肿瘤个体化诊断使用最广泛的技术[8]。

与肿瘤基因突变检测相关的PCR技术分为多种。荧光染料法是成本最低的一种检测方法，但由于染料分子可以与引物二聚体及反应体系中存在的一些双链结构DNA非特异性结合，易引起假阳性反应，该方法未得到临床的认可。Taqman荧光PCR方法因其灵敏度特异度较高、操作方便等优点在致病性病原体核酸检测方面得到临床广泛应用，但是对于基因突变而言，其灵敏度稍低。高分辨率溶解曲线法(HRM)依据DNA序列的长度、GC碱基含量的差异对基因突变进行分析，具有较高的灵敏度，但反应体系中探针引入与否分别存在缺乏扩增的特异性和体系设置较为复杂的缺点，也存在一定的局限性。扩增阻滞突变系统法(ARMS)，利用Taq DNA聚合酶缺少3′- 5′外切酶活性，PCR引物的3′端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同的已知突变，设计适当的引物以检测出突变基因，具有很高的灵敏度和特异度，目前已经成为临床广泛接受和使用的检测方法[9]。

2 肿瘤个体化诊断PCR检测试剂的注册申报基本要求

肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂是指利用分子生物学对人体来源的各种标本(主要是35%～40%的甲醛水溶液固定石蜡包埋的病理组织切片标本)的核酸提取液中的特定基因突变进行体外检测的试剂[10]。在我国，体外诊断试剂(IVD)根据风险程度高低依次分为第三类、第二类和第一类产品，肿瘤个体化治疗基因突变检测相关的体外诊断试剂作为第三类IVD产品进行管理。根据国家药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂注册管理办法》的有关规定，在国内，首次申请注册的IVD产品需完成产品研发、分析性能评估、注册检验及临床试验研究，并在提出注册申请时提交相关的试验验证资料。针对肿瘤个体化治疗基因如突变检测产品，我国近年来相继发布了《肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则》《人表皮生长因子受体(EGFR)突变基因检测试剂(PCR法)注册技术审查指导原则》等指南。由于该类产品生产研发的企业数量较多，方法学差异较大，相关技术更新较快，故医疗器械监管部门有必要根据不同类产品的特征进一步制订个性化的技术要求以指导注册申请人对申报产品进行合理的开发设计、验证与确认。本文将结合肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂的产品特征、临床预期用途、监管部门的法规要求及笔者近年来IVD产品技术审评工作的经验总结，对该类产品的标本处理、体系设置、质量控制等重点内容进行探讨并提出指导性建议，供注册申请单位及相关的临床研究单位参考。

3 肿瘤个体化诊断PCR试剂体系设置和质控体系设置的基本要求

由于肿瘤个体化诊断涉及的突变位点多且变异类型复杂，而临床对诊断试剂的准确度、特异度、精密度等均有明确的要求，因此，对PCR个体化诊断相关的核酸提取、PCR体系设置和质控体系进行合理要求十分必要。

3.1核酸提取和纯化 核酸提取和纯化是进行核酸扩增反应的重要步骤，核酸提取和纯化的质量(包括纯度和浓度)与效率是决定PCR成败的要素之一。临床上，用于肿瘤个体化诊断的人体标本包括新鲜组织、冰冻组织、经35%～40%的甲醛水溶液固定的石蜡包埋组织(FFPE)、血液等，其中最常见的标本类型为FFPE标本。组织标本离体后应使用10%中性35%～40%的甲醛水溶液尽快进行固定，以避免环境中的核酸酶对DNA，尤其是对RNA的降解作用，同时也应考虑标本处理过程中35%～40%的甲醛水溶液对核酸分子的影响。活检组织标本一般固定6～12 h，手术切除标本需6～48 h固定。

除了FFPE标本，血浆标本也是肿瘤个体化诊断产品的一种标本类型，如人肺癌EGFR基因突变检测试剂，在不易获得患者组织标本的前提下，可作为补充检测的一种标本类型组。由于血浆中来源于肿瘤细胞的核酸水平低，突变丰度低，且容易因血浆分离不及时导致血细胞裂解和基因组DNA污染，从而影响试验结果的准确性，因此，在该类标本处理过程中应考虑标本保存时间、标本保护剂及抗凝剂对核酸质量的影响。推荐使用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用采血管，采集10 mL全血并尽快分离血浆。

尽管市场上有多种针对FFPE和血浆游离核酸提取试剂盒，但质量良莠不齐，DNA和RNA提取质量难以保障，为保证PCR和逆转录-PCR检测效果，核酸提取试剂必须采用药监部门批准的核酸提取试剂，严格按照说明书要求进行操作，并对核酸提取和纯化的环节进行验证，同时在产品说明中对产品配套的核酸提取试剂予以明确。

3.2PCR试剂体系的设置

3.2.1引物和探针 引物探针的设计、合成与纯化是荧光PCR重要的环节。由于肿瘤个体化核酸试剂检测目标常为多个基因位点，在产品设计时多采用多重PCR技术，一管中扩增多个突变位点以满足临床的需求。在引物和探针设计时，有以下几点需要注意：(1)应尽量降低检测体系的复杂度，在同一反应体系内，如EGFR外显子19缺失检测，除针对缺失设计的特异性引物外，各种缺失类型检测应尽量共用另一条引物和探针；(2)分析目标检测基因是否存在假基因，若存在，引物探针应在目的基因与假基因有区别的位点处设计引物探针，以避免体系的非特异扩增；(3)同一反应管的多条引物自身和彼此之间不应存在互补序列，尤其应避免不同引物3′端的互补而形成引物二聚体；(4)如果检测需要多个反应管，除了保证单个目的片段扩增所需上下游引物的Tm值的一致性外，各管间引物Tm值、探针Tm应尽量保持一致，以保证各反应管扩增效率一致性；(5)探针在设计时Tm值应高于引物Tm值 7～10 ℃，以提高探针的杂交效率；(6)为保证有效扩增FFPE标本核酸，PCR扩增片段的长度建议小于200 bp，若标本类型为血浆游离DNA，PCR扩增片段长度建议小于160 bp[11-12]。

引物和探针合成质量的优劣也直接影响PCR反应的性能。由于合成的引物和探针中可能含有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整序列和脱嘌呤产物，这些序列可以导致非特异扩增和荧光信号强度的降低。因此，肿瘤个体化诊断核酸产品所用的引物和探针必须经过纯化。引物、探针合成时宜选择以下方式保证引物和探针的质量：(1)选择产品质量好且稳定的引物或探针合成机构；(2)选用合适的纯化方法(PAGE、HPLC或其余合适的方法)；(3)生产且针对用于生产的引物和探针设定质量控制标准，如分子量、水平、纯度等要求，针对探针还应明确荧光标志物要求。

3.2.2PCR所需酶的要求

3.2.2.1逆转录酶 对于融合基因检测而言，需要将RNA逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，因此，高效的RNA逆转录对于后续PCR检测至关重要。针对逆转录PCR反应体系中，逆转录过程受多个因素影响，如反应模式(一步法或两步法)，模版RNA的水平、质量、二级结构，目标序列的长度等。申请人应综合考虑上述因素，选择合适的逆转录酶。由于不同逆转录酶所需的反应条件和反应环境不同，企业应当对逆转录酶的效率及特异性进行验证。

3.2.2.2DNA聚合酶 PCR反应中DNA聚合酶的选择，对于实验的准确度、特异度、灵敏度和稳定性等性能至关重要。PCR聚合酶选择根据实验者的需求主要从扩增的效率和保真性这两个方面来考虑。尽管在市场上有多种耐热DNA聚合酶，但这些酶在热稳定性、扩增效率、移除错配核苷酸的能力上是有差别的，合理选择耐热DNA聚合酶是PCR成败与否的一个关键因素[13]。

由于肿瘤个体化诊断常常为多重PCR反应，为保证扩增的特异性，建议采用热启动Taq DNA聚合酶来降低引物的非特异性扩增，而耐热、高保真及核酸外切酶活性为选择Taq的主要原因。由于肿瘤组织中既含有突变DNA，也含有野生型DNA，而野生型DNA背景常常会影响突变DNA检测，因此，肿瘤个体化PCR产品宜采用同时兼顾扩增效率和特异性的DNA聚合酶，生产企业应针对核酸扩增酶设定相应质量控制标准，对供应商不同批次的酶的性能进行评价，在保证试剂高灵敏度的同时，要防止因DNA 聚合酶特异性差而造成的假阳性现象。

3.2.2.3尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶) PCR在扩增过程中产生大量的PCR产物，这些产物是PCR反应最常见、最重要的污染物。为了保证PCR扩增结果的准确性，企业应当采取措施避免因PCR产物污染而产生的假阳性结果。

UNG酶可以选择性水解断裂含有dU的DNA双链，在随后的变性条件下，该DNA发生断裂，不能够作为PCR模板进行扩增，从而防止扩增产品对扩增的影响；同时，在PCR变性过程中，高温使UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA[14]。建议企业以脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)部分或全部替代脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，且在反应系统中添加UNG酶，并对不同供应商来源的UNG酶性能进行验证。由于PCR扩增时dUTP的掺入效率要低于其他脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，因此，企业应当对各dNTP的用量和比例进行优化，以得到最佳的反应效率。

3.2.3反应体积 PCR反应体积对肿瘤个体化核酸检测试剂性能也有着明显的影响。反应体积越小，加入反应系统的模板数也随之降低，容易引起假阴性；反应体积越大，允许使用的模板体积也可放大，灵敏度随之提升。理论上讲，大体积的稳定性更好，实验的重现性也更好，但是，反应体系的增大会增加成本。因此，需要重点考虑PCR反应体积核酸扩增检测用试剂(盒)-YY/T 1182-2010行业标准中的要求，体外诊断用人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)核酸扩增检测试剂盒产品核酸加样体积不小于20 μL；总反应体积不小于40 μL。建议肿瘤个体化诊断PCR扩增类产品的反应体积为30～100 μL。

3.2.4PCR添加剂 部分化学因子、DNA结合蛋白及商业化试剂可以降低引物和模板的二级结构，使RNA二级结构打开，双链DNA变性完全；同时还可以提高DNA复性时的特异性配对，增加或改变DNA聚合酶的稳定性等，提高PCR的扩增效率。这些物质作为添加剂经常被加入逆转录体系或PCR体系中，常见的添加剂有二甲基亚砜、甲酰胺、聚乙二醇6000、甘油、甜菜碱和牛血清蛋白。但没有一种添加剂可以适用于所有的PCR反应体系，需要根据实际情况选择最优的PCR添加剂并对其用量进行优化。

3.3质控体系设置 为有效监控肿瘤个体化诊断试剂的假阴性和假阳性，肿瘤个体化诊断产品应从标本制备、配液及加样、试剂盒仪器性能、扩增反应抑制物、交叉污染、靶核酸降解等方面进行考虑，建立完整的质控体系。完整的质控体系包括外部体系质控及内部质控两个部分。

3.3.1外部质控设置 外部质控体系主要是指在进行目的基因检测的同时，平行设置已知结果的标本检测，主要监控荧光PCR检测的结果是否可靠。外部质控体系包括阳性对照、阴性对照(空白对照)。阳性对照主要作用是判断试剂是否正常扩增及扩增的效率是否有偏差。阳性对照在设置时应考虑以下几点：(1)阳性对照一般选择目的基因为扩增模版，扩增效率应与靶基因的扩增效率一致。(2)模版浓度不宜过高，避免在操作过程中因气溶胶污染而对其他待测标本产生假阳性；也不宜过低，以避免试验间阳性对照Ct值偏差过大，甚至出现完全无法检出的现象。(3)建议对于每一管反应，应设置相对应的阳性对照。阴性对照主要是判断试剂是否存在引物二聚体、交叉反应、强阳性污染等问题。阴性对照的选择可以是无模板的纯水，也可以是确定野生型的核酸，阴性对照每次的检出结果应该为阴性，说明实验结果较为可靠；也有实验者增加一个空白对照，即不加入任何模板或提取产物，仅仅试剂单独扩增，主要目的是监控实验室环境是否存在污染的风险。

3.3.2内部质控设置 内部质控则是对标本的制备、PCR反应体系及人员操作进行质控。内标的检测可以发现核酸标本中是否存在PCR抑制剂，也可以发现标本有无加入反应孔等操作问题。内标最好与标本中的靶核酸一起经历核酸提取过程，这样也可以作为核酸提取过程的质控。目前国内外传染性疾病荧光PCR检测产品大多含有内标，核酸扩增检测用试剂(盒)-YY/T 1182-2010行业标准也对此作出了明确要求，体外诊断用HIV、HBV、HCV核酸扩增检测试剂盒产品必须含有内标。

由于肿瘤个体化核酸诊断产品检测对象为人类核酸，若检测对象为DNA，建议以非靶基因DNA片段作为瘤个体化诊断产品的内标；若检测对象为融合基因，以与目标基因表达量相当的人类管家基因RNA作为内标。在设计内标引物和探针时，应避开内含子区，在相邻外显子两侧设计引物探针，因内标扩增与目的基因扩增公用一套酶及缓冲体系，所以应充分考虑内标扩增对靶核酸扩增的影响，并对反应体系进行优化。肿瘤个体化用药相关基因突变检测试剂技术审查指导原则要求企业应对内对照(内标)的引物、探针和模板浓度做精确验证，既要保证内标荧光通道呈明显的阳性曲线，又要尽量降低对靶基因检测造成的抑制而导致假阴性。

4 讨 论

肿瘤靶向药物发展迅速，并展示很好的临床治疗效果，而肿瘤靶向治疗的效果与肿瘤个体化诊断产品的质量密切相关，因此，核酸扩增检测试剂也需要在严格的体系设置要求下与药物共同发展形成完备的肿瘤个体化诊疗方案。国家药品监督管理局发布的《体外诊断试剂注册管理办法》《肿瘤个体化治疗相关基因突变检测试剂技术审查指导原则》和《人表皮生长因子受体(EGFR)突变基因检测试剂(PCR法)注册技术审查指导原则》仅对相关内容的要求概述，但并未对具体内容展开描述；特撰此文，指导相关生产企业对该类试剂的研发、生产；希望国产试剂提升产品质量，为公众用械安全提供保障。