microRNA在三阴性乳腺癌转移中的作用*

王舒淇 综述，王东生,2△ 审校

(1.川北医学院医学检验系,四川南充 637000；2.电子科技大学医学院附属肿瘤医院/四川省肿瘤医院研究所检验科，四川成都 610041)

乳腺癌是临床常见的一种恶性肿瘤，据国家癌症中心发布的2018年全国癌症报告显示，乳腺癌位居全国女性癌症发病首位。尽管靶向治疗及个体综合治疗发展迅速，乳腺癌仍然是当今女性癌症死亡的主要原因[1]。通过分析乳腺癌基因表达，将乳腺癌分为管腔上皮A型(LuminalA型、ER+或PR+、HER-2-)、管腔上皮B型(LuminalB型、ER+或PR+、HER-2+)、HER-2过表达型(ER-或PR-、HER-2+)、基底样型(Basal-like型、ER-或PR-、HER-2-)和正常乳腺样型[1-2]。其中基底样型也称三阴性乳腺癌(TNBC)，该类患者由于缺乏激素受体及人表皮生长因子受体，对激素治疗及靶向治疗均反应甚微，因此其5年生存率较其他类型乳腺癌患者低。此外TNBC更易发生于年轻女性患者，且具有高度转移性，可在3年内复发，远处转移常见于脑、肝、肺等[3]。为了能在早期发现TNBC的转移，改善预后,进而提高其患者生存率，研究者需要对转移相关信号通路及生物标志物有更多的了解及认识。microRNA(miRNA)是内源性非编码RNA，已被众多研究证实可参与细胞分化、增殖、代谢及凋亡等生物学过程。同样，在癌症发生、发展的过程中，miRNA的表达情况与疾病的发展也有着千丝万缕的联系，其中包括肿瘤转移。

1 miRNA的生物合成

miRNA是长度约为22～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA[4]，通过与其靶mRNA分子的3′端非翻译区(3′UTR)结合，从而发挥转录后调控的作用。miRNA合成首先发生在细胞核内，在RNA聚合酶Ⅱ的参与下，miRNA的编码基因转录为长链初始转录产物(pri-miRNA)，之后由Drosha/RNaseⅢ识别，剪切为发卡状结构的miRNA前体(pre-miRNA)[5]；随后被转运蛋白Exportin5转运至胞质内，被特异性的内切酶RNase Ⅲ Dicer裂解，最终形成成熟的miRNA[6]。miRNA与其靶标基因的mRNA互补程度决定了miRNA的作用结果，完全互补配对时miRNA会导致mRNA发生降解，而不完全互补配对时只能抑制靶基因mRNA的翻译，不影响靶基因mRNA的稳定[7]。自发现miRNA后的20多年间，癌症成为了该领域研究重点，许多研究发现miRNA参与了肿瘤生长、侵袭、血管生成或是免疫逃避等过程[8]。当然在TNBC的研究中，越来越多的miRNA被发现与疾病进展的关键过程紧密相连，如上皮细胞间质转化(EMT)、癌细胞获得干细胞样特性、迁移、转移扩散等等。目前，针对TNBC患者的有效治疗手段还相当有限，但随着miRNA研究的深入，相信其能为提示肿瘤或治疗靶点做出贡献。

2 miRNA与TNBC的关系

根据miRNA在肿瘤发生、发展中产生的不同作用，将miRNA分为肿瘤促进miRNA(onco-miRNA)和肿瘤抑制miRNA(ts-miRNA),通常onco-miRNA在肿瘤中上调，主要通过降解肿瘤抑制基因促进癌细胞生长；ts-miRNA则在肿瘤中下调，主要以癌基因为降解目标，因此具有抗肿瘤功能[3,9]。与正常组织相比，几乎在肿瘤发生过程的所有阶段(细胞周期、凋亡、侵袭、血管生成)都存在miRNA表达失调的情况。

在多项关于乳腺癌的研究中，研究者已经证实数个miRNA参与发挥作用。PEREZ-ANORVE等[10]研究表明miR-122上调可促进获得性耐辐射乳腺癌的细胞存活，并提示miR-122具有作为肿瘤抑制因子和依赖于细胞表型的onco-miRNA的双重功能，可在不同程度上控制对放疗的反应。BASOVA等[11]应用纵向多变量数据分析随机模型证实miR-155和miR-24可作为onco-miRNA，对早期乳腺癌复发有高度预测作用。SON等[12]报道miR-374a-5p在TNBC患者中特异性上调，可作为onco-miRNA靶向TNBC的ARRB1，从而促进肿瘤进展。另外miR-4417被发现是TNBC的肿瘤抑制因子和预后生物标志物，其表达在TNBC细胞从非恶性向恶性发展的过程中被抑制[13]。通过研究miR-4458与TNBC中SOCS1的关系，发现miR-4458直接与SOCS1结合，负调控SOCS1 mRNA和蛋白表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡[14]。

由此可见，miRNA与TNBC存在着一定的关联性，其表达量的变化可能成为TNBC诊断、治疗或预后判断的依据。随着越来越多新技术，如基因图谱和测序、蛋白质组学和miRNA分析等被用于探索包括TNBC在内的肿瘤发生和转移，新的治疗方法很有可能在不久的未来被发现。

2.1miRNA与TNBC的转移 肿瘤转移是恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过淋巴、血液等转移方式到达继发组织或器官形成肿瘤的过程，是一个多步骤、多阶段、连续复杂的生物学过程[15]，涉及多因素、多水平调节，其中包括肿瘤转移基因、转移抑制基因、细胞黏附因子、蛋白降解酶及机体免疫状态等[16]。恶性肿瘤的转移往往是肿瘤治疗失败,从而导致患者死亡的主要原因。随着对miRNA研究的深入，越来越多的研究表明miRNA可通过EMT、肿瘤干细胞(CSCs)、肿瘤血管再生、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)等途径调控恶性肿瘤的转移。

有研究者采用Solexa深度测序法检测TNBC细胞及非TNBC干细胞的miRNA表达水平，通过建立裸鼠动物实验、异种移植模型、荧光素酶报告基因分析等，证实miR-4319可以通过E2F2抑制TNBC肿瘤干细胞中肿瘤球的自我更新和形成，同时可以抑制肿瘤的转移[17]。在肿瘤细胞和巨噬细胞相互作用的研究中发现巨噬细胞通过miRNA或外泌体参与肿瘤的发生、发展。有研究表明乳腺癌细胞可在凋亡过程中释放高表达的miR-375，肿瘤源性miR-375可被CD36摄取，进而促进TAMs中miR-375的积累。在巨噬细胞中，miR-375可直接靶向TNS3和PXN，增强巨噬细胞向肿瘤的迁移和浸润；而在肿瘤细胞中，miR-375通过调节CCL2的表达来增加巨噬细胞的募集[18]。此外，miR-126-3p、miR-148a/152、miR-206均被发现参与TNBC血管形成过程[19-21]。

2.2miRNA参与TNBC的EMT过程 TNBC是乳腺上皮细胞来源的恶性肿瘤，而EMT可使上皮细胞来源的肿瘤细胞获得较强侵袭和转移能力,从而导致肿瘤的浸润、侵袭和转移。在EMT诱导过程中，多种信号通路(如Wnt/β-catenin通路、TGF-β信号通路、Notch、PI3K等)，可通过影响SNAIL1、SNAIL2、TWIST、ZEB1、ZEB2等转录调控因子，最终引起间充质标志物(如Vimentin、N-cadhefin等)表达上调，上皮标志物(如E-cadherin、zonula occluden-1等)表达下调[22-23]。许多研究表明miRNA可通过参与调节信号通路或转录调控因子在EMT过程中发挥作用。

miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)是被许多研究所证实的，在TNBC EMT过程中发挥负性调控作用的因子[24]。研究表明miR-200是癌细胞上皮表型的一个标志物,miR-200可直接靶向和下调E-cadherin转录抑制因子ZEB1和ZEB2[25]，导致乳腺癌细胞上皮表型的恢复,而抑制miR-200可降低E-cadherin的表达并增加波形蛋白的表达，从而诱导EMT[26-27]。有研究表明miR-200a可以抑制TNBC的迁移[28]；miR-200b可以抑制TNBC的EMT过程及迁移[29]；miR-200c可通过下调β-catenin和Vimentin，进而调节Wnt信号通路相关基因，最终抑制TNBC的EMT过程[30]。然而，miR-200家族在乳腺癌转移中的作用却存在争议。有研究者发现miR-200在小鼠乳腺癌细胞系中的过表达表现出促进远处转移[31]。所以，尽管越来越多的证据表明，miR-200家族调节E-cadherin的表达并参与EMT过程，但这并不一定能直接表明其能预测其侵袭性和转移潜能。显然，这其中的机制需要更深入、更系统的研究，才能确定该家族在肿瘤转移中的作用。

miR-124在肝癌细胞中通过靶向ROCK2和EZH2体外抑制EMT发生和张力纤维形成，体内抑制肿瘤肝脏和肺转移[32]。而在TNBC细胞中miR-124通过靶向ZEB2降低其侵袭、转移率，并抑制EMT过程[33]。表明同一miRNA在不同肿瘤中可发挥同样的抑制EMT过程的作用。

研究通过比较miR-125b在乳腺癌和正常乳腺组织中的表达，发现miR-125b在乳腺癌中的表达下调，提示miR-125b是乳腺癌的ts-miRNA，并发现其可能是通过靶向erbB2/erbB3通路或ETS1基因发挥作用[34-35]。然而又有研究者发现miR-125b在TNBC细胞MDA-MB-468中的表达明显上调，抑制miR-125b在MDA-MB-468细胞中的表达后，细胞增殖、侵袭性和迁移能力均有降低，因此，miR-125b又可作为TNBC的onco-miRNA[36]。由此可见，同一miRNA在同一肿瘤的不同亚型中可能发挥着截然相反的作用。

近来miR-30a被发现在TNBC中表达下调，其表达的降低与组织学分级和淋巴结转移有关,通过免疫荧光实验证实miR-30a的过表达增加了上皮标志物E-cadherin的表达，降低了间质标志物N-cadherin和vimentin的表达；而荧光素酶实验证实miR-30a特异性靶向ROR1，从而抑制TNBC细胞在体内外的侵袭和转移[37]。而另一项研究却观察到乳腺癌细胞中miR-30a的表达降低与p53失活有关，进而证明p53/miR-30a/ZEB2轴控制肿瘤细胞的侵袭和远端扩散，并影响miR-200c的表达[38]。这表明同一miRNA在同一肿瘤发展过程中可通过不同作用靶点调节EMT过程。

随着miRNA研究热度逐渐升高，越来越多的miRNA被发现在TNBC细胞EMT过程中发挥作用。例如，最新的一些研究表明miR-212-5p可通过下调Prrx2抑制TNBC获得EMT表型，从而抑制肿瘤进展过程中的细胞迁移和侵袭[39]；miR-3178通过靶向降低Notch1的表达，参与EMT，抑制TNBC细胞的增殖、侵袭和迁移[40]；miR-508-3p通过调控ZEB1表达，显著抑制TNBC细胞EMT过程[41]。这些发现均证实miRNA可作为重要的调控因子，介导EMT的发生，抑制肿瘤转移。

3 循环miRNA可预测TNBC转移

实验已经证实miRNA参与TNBC转移过程，在一定程度上能为TNBC早期转移提供依据，但患者于治疗过程中，反复行病理活检监测评估病情并不可行，此时一种可反复操作、微创且易于被患者接受的方法被研究者提出，即检测血清中的miRNA[42]。KLEIVI等[43]证实，血清中miR-18b、miR-103、miR-107和miR-652高水平与TNBC患者原发肿瘤切除后36个月内的肿瘤转移复发相关。又有研究通过与健康对照组比较，发现TNBC患者血清miR-940表达显著下调， miR-940低表达的TNBC患者总体生存率较miR-940高表达的TNBC患者低，且该miRNA水平与淋巴结转移和TNM分期有关[44]。同时，有研究者采用实时PCR技术检测血清中乳腺癌相关miRNA水平，发现miR-122、miR-21、miR-155在乳腺癌患者中表达明显增加，miR-126明显降低，且miR-122可在一定程度上提示转移；相较于使用酶联免疫吸附法测定血清CA15-3和CEA有更高的灵敏度，且与临床分期及组织学分级有更显著的相关性[45-46]。由此可见，循环中存在着提示TNBC转移的miRNA,但其在临床应用中的价值还需要接受更大规模临床病例的验证。

4 小 结

TNBC作为乳腺癌预后较差的一个类型，其缺乏特异性的靶向治疗药物且转移复发率高，导致患者病死率居高不下，因此备受关注。经过众多学者的不懈努力，发现miRNA不仅可作为TNBC分子特征，利于研究者对TNBC进行分型；另一方面miRNA更是一种易于检测的分子标志物，可用于TNBC的病情监测或治疗指导。通过综述miRNA在TNBC EMT调控转移过程可看出，EMT受到不同转录因子及信号通路的调控，而miRNA可通过多种途径参与其中，并且主要表现出抑制肿瘤的作用。

目前，许多miRNA被发现在肿瘤的体内或体外实验中发挥致癌或抑癌作用，但实际上其并没有发挥真正的诊断或临床治疗价值，并且在肿瘤转移过程中发挥作用的miRNA尚未被完全发现，但是理解并运用这些潜在的调控位点，寻找其上游或下游的作用基因，探讨其联合作用的临床价值，可以增强对肿瘤转移的认识,有利于找出早期提示肿瘤转移的标志物或控制肿瘤转移的有效途径。

作为检验工作者，无论是组织标志物(如尿激酶纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活剂抑制剂、组织蛋白酶D)、遗传标志物(如BRCA1、BRCA2、DNA倍性)、血清标志物(如CA-549、MCA、MUC-1)[47]，亦或是循环miRNA,研究者期望能够通过改进实验方法，发现利于早期诊断乳腺癌或提示乳腺癌转移的高特异度、高灵敏度标志物。例如，LEE等[48]利用等离子体头部植绒金纳米柱的表面，增强拉曼散射传感器，定量、特异地检测乳腺癌外泌体miRNA，得出一种高选择性、高灵敏度的检测外泌体miRNA的方法，对早期肿瘤诊断有重要意义，从而在肿瘤发生早期或肿瘤转移早期提示临床，达到改善患者预后的期望。