微流控LAMP技术在呼吸道病原体检测中的临床应用进展*

杨家树，戚丽华，吴 方，袁永阳 综述，刘 杰，△ 审校

(1.南方医科大学第二临床医学院，广东广州510280；2.中国人民解放军总医院第七医学中心检验科，北京 100700；3.陆军第九五七医院检验科，西藏阿里 859000)

呼吸道感染是一种呼吸系统的常见病，在季节变换期间更容易发生。流感病毒也极易感染人群，从而引起流感的暴发。目前病原微生物从鉴定到药物敏感性检测，其过程一般是2～3 d，结核杆菌的培养检测通常要14～35 d，这很难满足临床对致病菌快速诊断的要求[1]。由于核酸分子检测的高特异度和高灵敏度的特点，近年来随着核酸扩增技术的快速发展，越来越多的新型扩增技术也发展起来。微流控技术和环介导等温扩增(LAMP)技术的结合，使得微流控LAMP技术不仅具有PCR技术的高灵敏度和高特异度，同时操作过程变得十分简单，特别适用于基层医院和偏远地区。但核酸提取速度是制约微流控LAMP技术发展的重要因素，快速核酸提取的发展会进一步提高微流控LAMP技术的发展前景。

1 微流控芯片和LAMP技术原理

1.1微流控技术 20世纪末微流控技术研究开始发展，它是由微结构和微通道组成，运用了微电机系统、微流体技术、生物、化学等多方面技术。它可以在微纳米级别的空间内精确操控微尺度流体。微流控芯片又叫“微流控芯片实验室”，它可以巧妙地把整个分析过程的基本操作集成到一片微米尺寸的芯片上，自动完成分析的全过程，具有规模集成、仪器微小化，节约试剂等众多优点，特别适用于即时诊断(POCT)和基层工作单位[2]。

1.2LAMP技术 自日本学者NOTOMI等[3]首次发布了LAMP技术以来，该技术发展迅速，其原理是通过对目标基因的6个特异区域设定4种引物，在恒温条件下依赖一种具有链置换活性的DNA聚合酶，生成自我循环扩增的颈环结构，使得目标基因在短时间内大量、高效地扩增。该技术具有较高的灵敏度和特异度，且速度快，只需要1 h左右即可检测出病原菌，比传统PCR技术节约时间，可以满足临床上快速检查病原菌感染的要求；同时它所需要的设备比较简单，只需要一个恒温箱，这大大减低了对大型实验室仪器的依赖，更易于在基层医院开展分子检测。

1.3微流控芯片和LAMP技术的结合检测 微流控芯片可以减少对实验场地和大型实验仪器的依赖性。LAMP技术则可以从分子方面更加准确地诊断呼吸道感染的病原体。微流控和LAMP技术的结合，增加了仪器的便携性，可以节约时间和试剂，同时对病原体的快速检测有助于临床诊断和指导临床医生针对性用药，也避免了LAMP技术气溶胶的污染[1,4]。在金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的检测中，有研究证明微流控LAMP技术均有较高的灵敏度[5-6]。在儿童感染性呼吸道病原体方面，与应用较多的传统痰培养和血清学方法相比，微流控LAMP芯片法具有较高的检出率[7]。

2 微流控LAMP技术在呼吸道感染疾病病原诊断的临床应用

呼吸道感染在临床呼吸内科中的发病率总是居高不下，呼吸道感染疾病按致病菌分为3类：细菌性感染、真菌性感染和病毒性感染。微流控LAMP技术作为一种快速核酸扩增技术，特别适用于临床病原菌的快速诊断[8]。

2.1微流控LAMP技术在细菌感染中的应用 LAMP技术较早地应用于结核分枝杆菌的诊断，传统结核分枝杆菌的鉴定通常依赖于罗氏培养基，但是其培养时间较长，不利于临床的早期诊断。SEKI等[9]利用LAMP技术检测结核分枝杆菌的共有基因hspX诊断其感染。大部分微流控LAMP技术只能证明病原体的存在，不能区分菌体是否存活及反映病原体感染性强弱[10]，因为即使细菌死亡，其DNA依然存在于人体内，因此对临床用药剂量指导和判断是否为急性感染有一定的限制。WU等[10]认为可以通过RT-LAMP检测结核分枝杆菌的16S rRNA基因，区分出存活状态的结核分枝杆菌。支原体肺炎是社区感染性肺炎的常见病原菌，研究表明检测支原体时，LAMP技术的灵敏度和特异度分别为100.0%、94.3%[11]。有学者证实了LAMP技术在金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和流感嗜血杆菌检测中的应用[12-15]。

2.2微流控LAMP技术在呼吸道病毒感染中的应用 LAMP技术通过逆转录形成的RT-LAMP技术可以用于呼吸道病毒的快速检测。高杰等[16]利用RT-LAMP技术检测了甲型H1N1、季节性H1N1和季节性H3N2亚型流感病毒及乙型流感病毒，结果显示RT-LAMP技术在流感病毒检测中与荧光定量PCR技术具有相当的灵敏度和特异度。MU等[17]利用人类呼吸道合胞病毒(HRSV)A组和B组特异的引物，分别扩增HRSV的N和L基因，设计出逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)测定法，1 h内可以同时检测A和B两组HRSV，较为快速方便。

2.3微流控LAMP技术在真菌感染中的应用 侵袭性真菌感染大多是继发性，临床对其缺乏可靠性的病原学诊断[18]。LAMP技术作为一种分子诊断技术，在侵袭性真菌的快速诊断方面有着广阔的应用前景。肖晶晶等[19]针对白色念珠菌的RPS0基因，利用LAMP技术建立了检测白色念珠菌的诊断方法，其检测的灵敏度和特异度分别为87.62%和88.33%，均高于PCR法。

3 微流控LAMP技术的技术缺陷及快速核酸提取改进技术

微流控和LAMP技术的结合大大简化了操作步骤，提高了该技术的应用范围。但微流控和LAMP本身的技术缺陷制约了该项技术发展，同时不能有效简化核酸提取技术也限制了其应用[20]。

3.1微流控LAMP技术的技术缺陷 LAMP技术自发明以来因其具有较高的灵敏度和特异度、检测速度快的优点而备受欢迎，但因其引物设计复杂，扩增需要多对引物容易引起非特异性扩增，使得假阳性率较高[20-22]。 在检测致病菌DNA或者RNA时，大部分微流控LAMP技术检测结果多为定性而不能定量，所以目前不能有效反映病原体感染性强弱[10]。微流控LAMP技术多以微流控芯片为基础进行巧妙结合，一定程度上增加了其实用性。目前微流控技术因其精确的微型流体控制技术而被广泛应用，但在制备过程中由于技术受限、芯片对生化试剂有吸附作用等因素在一定程度上限制了其推广范围[4,23]，而且在集成样本核酸提取方面，由于难以精确控制气压使得样本的核酸提取仍然是一个难以解决的关键问题。不过微流控技术依然是最有希望将核酸提取、扩增和检测集成为一体的技术[1,4,22]。

3.2微流控LAMP的快速核酸提取技术 LAMP作为新型核酸扩增技术，依赖其检测特点在呼吸道致病菌快速检测中发挥重要作用。在下呼吸道感染中检出率和灵敏度均高于普通痰培养[24]。目前LAMP技术主要困难在于病原体核酸的快速提取。在进行病原体检测时，不能简化核酸提取，也限制了LAMP技术在病原体检测中的应用[4]。常用的核酸提取方法包括：煮沸法、细胞裂解法、柱式过滤法和磁珠法。进行提取DNA时，煮沸法和细胞裂解法方便、经济、操作简单，提取过程中没有DNA的损失；柱式过滤法和磁珠法可以有效清除干扰PCR扩增的物质，同时提取核酸纯度高，但是过滤法在DNA损失方面比磁珠法更严重，同时在不同浓度、不同菌种的条件下，细胞裂解法的Ct值更小[25]。近些年有学者对这几种核酸提取技术进行简化，一定程度上提高了微流控LAMP技术的实用性。

赵升等[26]通过一种快速核酸提取试剂检测流感病毒时得到较高的提取效率，与离心柱法和磁珠法相比PCR结果相似。该提取试剂所有成分均在一管中，通过加热裂解液破坏病毒外壳，释放核酸，核酸稳定剂防止核酸降解，裂解成分降解后，核酸分布于提取液上层，整个过程只需加热和震荡2个步骤，时间为4 min。KAWANO等[27]采用超快速提取(PURE)试剂盒，它的作用方式是使用一种吸附粉末，移除样品中的DNA抑制剂，达到保护样品DNA的目的，不需要复杂的设备即可在临床样品中分离DNA。孙魁[28]利用碱裂解法与纸基核酸提取技术，建立了碱裂解法结合纸基核酸纯化的样本处理体系(ALP FINA)，原理是利用强碱使核蛋白、核酸酶变性，使得DNA释放，利用过滤膜进行过滤得到核酸提取液，15 min左右即可得到提取液，整个过程不依赖电力、加热和离心，可以方便地达到核酸提取，可用于恒温扩增技术。

4 小结与展望

LAMP技术因其恒温扩增，操作简单，高灵敏度和高特异度的优点而被越来越广泛地应用。微流控的应用减少了常规检测对大型仪器和场地的依赖性。微流控LAMP技术鉴定致病菌因具有快速、高灵敏度和特异度的特点在临床呼吸道感染中拥有较大的应用前景。微流控LAMP技术的结合不仅简化了操作步骤，使得核酸分子检测技术易于操作，同时也解决了LAMP技术的一些弊端。但是快速提取核酸仍然是目前限制微流控LAMP技术发展的因素，其次微流控和LAMP法的本身技术缺陷以及结果不能定量也限制了其临床应用。随着科学研究的不断深入，微流控LAMP技术不断地改善和发展，它在病原体检测方面将会发挥更大的作用。