羊痘病毒研究综述

黄学圣，陈轶霞，赵诗佳，宴铭英，龚璟晖

（西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

羊痘病是养羊业中较为常见的疾病，该病流行范围广，每年各地区时有发生，以春、秋两季流行最为多见。羊痘病毒是导致羊群出现羊痘病的病因，羊痘病毒会导致绵羊感染出现绵羊痘（Variola caprina；Sheep pox；SPV），山羊感染出现山羊痘（Variola caprina； Goat pox；GPV），是一种感染性很强的急性传染病，可通过接触进行病毒的传播。羊群感染该疾病时，皮肤、黏膜处会出现大量的丘疹、结痂、水疱，严重威胁羊群的生长发育[1]。动物痘病中羊痘病毒是危害最大也是最危险的一种，感染羊痘病毒的羊群将会给当地畜牧业造成严重的经济损失[2]。不同的菌株在感染羊群后所表现出的毒力不同，有的毒株致死率为10%～58%或达到75%～100%。在易感的羊群中，可以导致刚出生不久的小羊的病死率高达100%，而在妊娠中的母羊则极易发生流产[3]。

1 病原分类及形态特征

1.1 病原的分类

羊痘病毒属于痘病毒科，脊索动物痘病毒亚科，羊痘病毒属。其中包含两种具体的病毒，一是绵羊痘病毒，简称为SPPV，二是山羊痘病毒，简称为GTPV。分析羊痘病毒的遗传物质，能够得到的结果是，DNA为该病毒的遗传物质，并且是线性双股的，特别之处在于，在具有相同类型的病毒中，可以在细胞质中复制，而且在结构上有囊膜，长度在150 kb左右[4]。

1.2 形态特征

使用电子显微镜，可以看到羊痘病毒的具体形态，在病毒发展的初期阶段，大多是卵圆形的，大小一般在 250～350 nm；成熟后的羊痘病毒在电子显微镜下观察，也多呈现为卵圆形，大小约为（150～180）nm×（150～180）nm[5]。当病毒已经进入到宿主细胞中时，宿主细胞也一般是椭圆形的，且会产生胞浆包涵体。观察外层的病毒粒子的结构可以发现，其外层是管状形的，在其脂蛋白膜外面，有两个哑铃形状的核酸芯髓[6]。该病毒的核酸是由双股DNA组成的，分子质量在（130×106）ku～（240×106）ku左右。

1.3 传播途径

羊痘病毒传染性强，无论是哪种年龄阶段以及品种的羊都是该病毒的寄主。羊群一般都为集中饲养，羊舍拥挤，感染的羊与健康的羊接触密切，导致该病传播率高，爆发迅速。羊痘病毒在痂皮内也可存活很久，不慎接触的羊也会感染该病毒。但该病主要由呼吸道感染传播，或由近距离接触感染动物、或间接传染。病毒可通过体液、皮肤及黏膜伤口进入动物体内，蚊虫叮咬也会导致该病毒传播[7]。

2 临床症状

羊在感染羊痘病毒后有一段时间的潜伏期，一般情况下潜伏的时间为6～8 d，山羊痘病的感染潜伏期为5～10 d。羊感染病毒后最先表现为精神萎靡，呼吸不畅，食欲不振，呼吸短促等，伴有流涕、结膜充血、眼睑肿胀、体温升高等症状[8]。羊的皮肤黏膜上出现痘疹是羊痘病临床上最典型的病变症状。受到该病毒感染的羊，一般会在鼻子、眼睛、尾根和乳房等部位出现痘疹。痘疹初始为红斑，随后迅速形成直径3～5 mm的硬圆丘疹。丘疹经5 d左右会形成水泡，水泡经过2～4 d变成脓包，脓包持续2 d左右会干燥结痂脱落。

3 病原分子的生物学特性

SPPV与GPPV同属的病毒的基因都是在150 kb左右，具有很高的同源性，并且，对于二者的核苷酸进行研究之后就会发现，大约96%的序列都是一致。在CPV基因组中，在其中间含中间编码区，与其他痘病毒的结构是一致的，并且还具有反向末端重复序列（Inverted terminal repeat，ITR），且两端的序列是相同的。在GTPV和SPPV基因组中，可以发现二者都存在147个开放阅读框（ORF），可以进行编码的蛋白的数目很广泛，一般是可以对53～2 027个氨基酸进行编码，编码密度为93%。对于这类的病毒的基因组中间的区域（ORFs024～123）与编码病毒复制所需蛋白质的其他痘病毒进行比对之后，发现它们具有同源的保守序列。其在病毒的复制中主要是担任病毒的转录、DNA 的复制与修复RNA的作用，此外，也可以进行成熟病毒粒子的胞内组装。在该基因序列的两端，一端是ORFs001～023，另一端是ORFs124～147，包括一个有8个基因的基因家族，以及与逃避宿主的免疫识别和反应的一些基因，主要是在编码表皮生长因子样蛋白（EGF-like protein）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpin）、胞质分裂丝蛋白、PKR 阻遏蛋白、白细胞介素-10（IL-10）等起作用，并且，该基因序列还可以对宿主进行一定的选择且有一定的致病性，这些是痘病毒所特有的。在该病毒基因组的尾端，存在一个类似发夹的环形结构，经过测定，其大约有75%的（A+T），发夹结构以及末端重复序列至少有200 bp[9]。虽然，GTPV与SPPV具有很高的同源性，但是在基因组末端的某些毒力基因和宿主嗜性功能基因上存在一定程度的序列差异。这些差异主要存在于基因组两端和推测具有毒力和宿主范围功能的基因当中。如对于二者的末端的 ITRs就存在很大的差异，GTPV为2 198 bp，SPPV为2 213～2 349 bp；二者的串联重复序列也有一定的差异，在距离末端（ORF001和ORF147）的区域最近的地方，SPPV有46 bp的ORFs，但GTPV却并不表达这一末端重复序列。

4 诊断方法

根据临床表现特征和流行病学症状观察，就可以判断羊是否感染上该类病毒。但若有非典型病例出现，则需要在实验室中用分子学或血清学等方法才能确诊。羊痘病毒的诊断方法常用的有ELISA方法、PCR鉴定法、电镜观察法、血凝试验、琼脂扩散实验、细胞中和试验。

利用PCR序列扩增的方式可以很快地得到大量从活组织中取出的SPPV的DNA片段。Ireland D C[10]利用SPPV基因组的融合蛋白和P32蛋白设计出特定的引物，能特异性扩增出SPPV，然后，基于限制性内切酶EcoRⅠ和DraⅠ特殊的识别位点，从而来对PCR产物进行验证分析。Balinsky等建立了实时PCR方法，该方法只需2 h就能从血清层、鼻拭子、口腔拭子和皮肤病灶处检测出病毒[11]。

另外，临床有的还使用血清学的诊断方法，比如说，间接免疫荧光实验、ELISA、琼脂扩散实验（AGID）等。但是使用该方式时需要注意抗体交叉反应的问题。由于副痘病毒和羊痘病毒的血清型极为类似，从而会导致对来自牛、绵羊、山羊病毒毒株的混淆。最近，在Western Blot免疫印迹实验的基础上，对羊痘病毒的P32抗原和待检血清进行检验，效果较好。Carn V M等[12]在克隆P32基因之后，并将该基因移植在大肠埃希菌中，最终将该基因以融合蛋白的形式进行表达，此后，基于上述产生的重组抗原，成功建立起新型的ELISA诊断试剂盒，可以用于单克隆抗体的生产。新试剂的出现使得ELISA特异性得以不断提高。

5 免疫与疫苗

痘病毒可以对很多的免疫基因进行重新编码，从而使宿主免疫反应不起作用或作用较弱。Abu-El-Saad等使用成年瑞士小白鼠实验，对小白鼠进行SPPV灭活苗或减毒苗接种，结果发现接种疫苗12 h后疫苗注射部位的巨噬细胞功能降低，有利于病毒的入侵。机体在被SPPV感染后，T细胞激活并分泌细胞因子很可能需要5 d时间[13]；SPPV如何入侵并逃避宿主免疫反应，其能力并不是依赖于病毒的感染力，而是病毒入侵之后，改变脾脏的巨噬细胞和淋巴细胞的活性，使得巨噬细胞和淋巴细胞的代偿性增强，从而让宿主免于受到局部免疫抑制而造成的致命后果[14，15]。

在预防羊感染这类病毒方面，可以使用灭活疫苗或者弱毒疫苗，但是使用前者的效果不好，一般不使用，因为只能实现较短时间的免疫。制备羊痘病毒活疫苗时可以使用致弱后的病毒毒株，虽然降低了病毒的活性，但是进行接种之后，还是会有较强的免疫反应。其缺点在于，即使接种了弱毒疫苗，还是会导致羊产生痘疹反应，如果情况严重，甚至引起死亡[16]。

被羊痘病毒感染后恢复健康的羊会产生终身免疫力，使羊不会再患上其余的羊痘病毒[17]。目前，研制出更高效更准确的基因工程疫苗一直是研究人员的目标。由于CPV的基因组比一般的病的要大得多，这也增加了外来基因进行表达的能力。利用这一点，可用在GTPV的非编码区中把插入外来基因，这样做的好处在于不会对其自身的复制产生影响，也对其抗原性无影响，因此，可以利用这个优势，生产重组疫苗。如将牛瘟病毒（Rinderpest virus）、小反刍兽疫病毒（Pestedes pttits ruminants virus，PPRV）基因在羊痘病毒载体中进行表达，基于这个产出的重组单一疫苗，对牛瘟、羊痘、小反刍兽疫都会有不错的效果[18，20]。

在发现羊痘病毒P32蛋白的免疫原性等对羊痘病毒有很好的防治作用后，P32蛋白仍是近几年来防治羊痘病的研究热点，其在预防CPV感染中也有重要作用[21]。因为P32蛋白免疫原性很强大，所以能通过诱导之后产生中和抗体，但由于P32蛋白表达量低且不稳定，关于P32蛋白的应用方法还有待进行更多的研究[22]。

如今生命科学领域的技术正蓬勃发展创新不断，很多研究学者都对羊痘病毒作为活载体疫苗的研究做出了巨大的贡献。Berhe等[23]人就通过生物科技手段，成功实现了小反刍兽疫病毒F基因的重组羊痘病毒的构建。Aspdcn等[24]也在狂犬病病毒糖蛋白的重组羊痘病毒中取得了巨大的突破。

6 展望

防治羊痘病毒对羊的侵害应该以预防为主，治疗为辅。近年来，畜牧业遭受羊痘病毒感染而造成经济损失的报道仍有发生，研究出快速、准确、有效的检测和预防方法势在必行。畜牧业在我国经济发展中起着重要推动作用，但我国对于SPV和GPV的研究仍落后于欧洲等发达国家。虽然实验室中已有用于诊断羊痘病毒的分子和血清学方法，但市场上，质量不同的诊断试剂盒对诊断结果的准确性仍存在较大的误差，因此，预防羊痘病也存在困难。

在生命科学的分子生物学领域快速发展的今天，普通民众也逐渐加深了对基因的认知，人们对基因的研究也更加深入，期望以更了解病菌致病的机制以用于防疫。目前，研究人员对羊痘病毒的免疫和致病机制的研究较少，必须加强对羊痘病毒基因组特性的研究，才能很好地对羊痘病进行预防和治疗，尤其是对P32蛋白、活载体疫苗的认识要更为全面。