细胞外基质的调控与肾间质纤维化的研究进展*

梅昭， 郑铁骑， 牟丽云， 邢翔飞△

1三峡大学人民医院，宜昌市第一人民医院药学部(湖北宜昌 443000)； 2三峡大学医学院(湖北宜昌 443002)

肾间质纤维化(RIF)是由各种病因导致的进行性肾病进展至终末期的共同通路，其病理特点是细胞外基质(ECM)合成增多与降解减少，表现为细胞与基质相互作用失调，炎性细胞浸润和固有细胞转化[1]。病理状态下，促纤维化的细胞因子表达增加，过多的ECM在肾间质沉积，加上降解酶系调控减弱是导致RIF的主要原因[2]。因此，抑制引起ECM合成增加的细胞因子和平衡降解酶系的比例，可延缓和改善RIF的进展。本文就促纤维化因子和降解酶系调控ECM的作用机制和治疗现状进行综述，为RIF的防治提供参考。

1 ECM的组成

ECM是细胞赖以生存的微环境，由多种不溶性大分子按一定比例和结构构建的具有特定物理特性和空间构象的动态网络结构；其为细胞提供适当的化学和机械信号，具有连接、支持、抗压等功能，还与细胞直接进行信号传导，调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡，维持组织的稳态和功能[3]。从组成成分来看，ECM主要由纤维蛋白和多糖蛋白组成：纤维蛋白充当基质的骨架，分为结构蛋白和黏合蛋白，前者有胶原蛋白(collagen)和弹力蛋白(elastin)，后者有纤维连接蛋白(FN)和层黏连蛋白(LN)；多糖蛋白以高度亲水的凝胶状态填充在骨架空间，包括蛋白聚糖(proteoglycan)和氨基聚糖(GAG)(硫酸肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素、透明质酸)[4]。从空间结构来看，ECM主要由基底膜(BM)和间隙结缔组织(ICT)构成，前者包括Ⅳ、Ⅶ型胶原、LN、蛋白聚糖等，后者有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅸ型胶原、FN及各种蛋白聚糖[5]。

2 ECM的来源

肾脏ECM主要来源于成纤维细胞和肌成纤维细胞(MF)[6]。生理条件下的成纤维细胞大多处于静息状态，只有其中一部分产生少量ECM，维持肾间质基质平衡。MF既有成纤维细胞的胶原合成能力，又可表达平滑肌细胞的特征α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，是产生ECM的主要效应细胞。正常肾脏中没有MF，而在RIF中可检测到大量的MF[7]。其来源于多条途径：肾间质成纤维细胞、肾小管上皮细胞/内皮细胞转分化(EMT/EndoMT)、周细胞增生、循环中纤维细胞浸润及骨髓来源的巨噬细胞直接转分化(MTT)[8]。MF以合成和分泌ECM为主，同时还分泌基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)抑制基质金属蛋白酶(MMPs)对ECM的降解。MF分泌ECM使其组成和含量发生变化，引起细胞生物学行为改变，导致肾脏结构发生不可逆的病变。

3 ECM的调控

肾脏ECM 的调控受到体内促纤维化因子和降解酶系统共同作用。ECM的累积取决于促纤维化因子的失衡，促纤维化因子主要包括转化生长因子-β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、血小板衍生因子(PDGF)；ECM的降解主要取决于降解酶系，其中MMPs/TIMPs系统起主要作用。

3.1 促纤维化细胞因子

3.1.1 TGF-β1 TGF-β是一种主要来源于淋巴细胞、单核细胞、血小板等，调节细胞生长与分化的多肽。其由2条分子量12.5 kD 肽链构成二聚体，每条肽链均含112个氨基酸，是最重要的促纤维化因子。TGF-β有5种亚型，哺乳动物中以TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3种形式存在，而以TGF-β1最为重要。肾脏中TGF-β1主要分布于肾小球系膜细胞、肾小管及肾间质细胞[9]，其受体广泛分布于各种细胞。TGF-β受体(TβR)有TβRⅠ、TβRⅡ、TβRⅢ三类，其中Ⅰ、Ⅱ类受体(均属丝/苏氨酸激酶受体家族)参与TGF-β1信号转导。TGF-β1通过刺激肾脏固有细胞增加ECM的合成、抑制MMPs和纤溶酶源激活物(PA)的活性及促进TIMPs和纤溶酶源激活物抑制剂(PAI)的合成使ECM降解减少、促进细胞表面ECM受体-整合素的表达使细胞与基质黏附性增强、诱导肾小管上皮细胞凋亡或EMT[1]，最终导致肾间质纤维化。

TGF-β1主要通过激活下游的Smad和non-Smad信号转导参与肾纤维化过程。经典的TGF-β/Smad信号通路中，活化的TGF-β1与TβRⅡ结合，激活的TβRⅡ募集TβRⅠ，导致Smad2和Smad3磷酸化，活化的Smad2/3与Smad4结合，使整个复合物转移到细胞核中以增加FN、α-SMA、胶原蛋白基因的转录[10]。Smads蛋白家族中Smad3是肾纤维化和炎症损伤的重要致病因子[11]，而Smad2和Smad7具有肾脏保护作用[12]。TGF-β1还可激活non-Smad信号通路，包括Wnt/β-catenin信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信号通路、PI3K/Akt信号通路、Notch信号通路等，参与肾纤维化。

靶向TGF-β1/Smad信号通路来改善RIF取得一定进展。Akagi等[13]早先报道转染反义寡脱氧核苷酸(ODN)的小鼠肾脏中TGF-β1的mRNA表达下调；肾小球肾炎的大鼠体内注射抗TGF-β1中和抗体可以明显减少ECM含量[14]；抗Thy-1 肾炎的大鼠腹腔注射全人抗TβRⅡ单克隆抗体(hTGF-βⅡRAb)后，系膜扩张程度减轻，α-SMA、FN及Col Ⅰ显著减少[15]，说明靶向TGF-β1/Smad信号通路的各个节点，均可改善肾纤维化，但TGF-β1活性广泛，过度抑制亦会引起其他病理变化。最近研究的双特异性抗体TGF-β + FnEDA DVD-Ig或 FnEDA mAb显示出明显的优势，该抗体分子一部分靶向纤维连接蛋白外域A亚单位(FnEDA)，另一部分中和TGF-β1，在阻塞的肾纤维化部位浓度较高，非阻塞部位浓度低，不影响正常部位TGF-β1的活性[16]。

3.1.2 CTGF CTGF又称CCN2，是CCN蛋白家族(CYP61/CTGF/NOV)中研究最为深入的成员，由349个氨基酸组成的分子量为34～38 kD的富含半胱氨酸的分泌肽。CCN参与调控多种重要的生物学功能，包括细胞增殖、分化、黏附和血管生成，以及肿瘤发展和组织纤维化等病理过程[17]。CTGF在人体多种组织中均有表达，生理条件下，肾小球上皮、近曲小管和间质成纤维细胞均可分泌少量CTGF；在慢性肾疾病进展中，CTGF的表达显著增加。

CTGF启动子序列-162 bp和-128 bp之间存在TGF-β1的调控元件，认为CTGF是TGF-β1的直接下游信号。CTGF生物学特性广泛：(1)与多种特定受体结合启动信号转导；(2)可结合细胞因子，介导与细胞表面受体结合和下游信号通路的启动；(3)CTGF通过与ECM蛋白结合介导基质转化；(4)调节信号网络通路，参与细胞因子和生长因子活性的调控[18]。在RIF的进展中，CTGF调节血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态生成蛋白(BMP)[19]，与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP6)相互作用，激活Wnt通路和增强胰岛素生长因子(IGF)和胶原蛋白表达而发挥促纤维化作用[20]。

CTGF结构域4显示最广泛的促纤维化活性，用特异性针对CTGF结构域4的封闭抗体或重组DKK-1(LRP6的内源性抑制剂)能有效抑制UUO大鼠肾脏的炎症和纤维化，说明CTGF结构域4可作为肾纤维化的治疗靶标[21]。Sirtuin蛋白1(Sirt 1)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰酶，通过促进染色质沉默和转录抑制来调节各种生物途径，可抑制纤维化和氧化对肾脏起保护作用[22]；SRT1720，一种Sirt1的激活剂，在UUO大鼠模型中可降低氧化应激和下调TGF-β1/CTGF的水平来改善RIF[23]，Sirt1激活剂可能成为下调CTGF治疗肾纤维化的候选药物。

3.1.3 PDGF PDGF家族包括由PDGF-A/B/C/D 4个配体及PDGFR-α/β 2种酪氨酸激酶受体链，构成的二聚体PDGF-AA/BB/CC/DD/AB和PDGFR-αα/ββ/αβ组成[24]。在人体肾脏中，PDGFR-α和PDGFR-β在肾间质细胞，即肾小球系膜细胞、间质成纤维细胞和血管平滑肌细胞中持续表达[25]；PDGF亚型在血管平滑肌和系膜细胞中几乎都有表达，PDGF-AA、-CC和-DD在部分肾小管和集合管中表达，损伤后的PDGF-BB和-DD在肾小管细胞中高度表达[26]。PDGF-αα能结合PDGF-AA/BB/CC，PDGFR-ββ与PDGF-BB/DD有高度亲合性[24]。PDGF是重要的促有丝分裂剂，可刺激系膜细胞、成纤维细胞的增殖和ECM的积聚。

PDGF与PDGFR特异性结合后使受体二聚化和自身磷酸化，致使酪氨酸残基暴露SH2结构域和底物蛋白分子结合，引发下游多条信号通路：(1)Ras/ERK通路：PDGF与PDGFR结合后，活化Ras-GTP，启动MAPKs三级酶促级联反应，依次激活Raf1、MEK1/2和ERK1/2，引发细胞生长、分化、迁移等过程[27]；(2)PI3K/Akt通路：PDGF与PDGFR结合，激活PI3K, 使PIP2磷酸化生成PIP3，进一步使Akt磷酸化而激活，PDGFR激活的PI3K/Akt通路可促进肌动蛋白重组，增加细胞迁移，介导代谢调节，刺激细胞生长和抑制细胞凋亡[28]；(3)PLC-γ通路：PDGF与PDGFR结合后，PLC-γ被酪氨酸激酶激活，产生的IP3，促使胞外Ca2+内流，胞内Ca2+浓度升高促进细胞分裂、增殖[29]；(4)JAK/STAT：活化的PDGFR通过JAK触发STAT蛋白的磷酸化，激活STAT5，进入细胞核，激活靶基因，促进细胞生长和分裂[30]。

PDGF亚型中，PDGF-B/D与其受体PDGF-β在RIF发展中具有关键作用。肾脏疾病模型中，系膜细胞、内皮细胞、肾小管细胞和间质细胞中可检测上调的PDGF-B/D受体PDGF-β，特性阻断PDGF-D介导的PDGFR-β信号转导，可显著降低大鼠系膜细胞增殖和ECM的积聚[31]，提示PDGF-D可能是对抗肾纤维化的合适治疗靶点。

3.2 ECM降解酶系 肾脏中ECM的降解主要取决于MMPs/TIMPs的动态平衡[32]。MMPs是钙锌依赖蛋白水解酶，几乎能降解ECM的所有成分；目前已明确的有26种，根据作用底物的差异可以分为六大类[33]：(1)胶原酶(MMP-1/8/13/18)主要水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；(2)间质溶解酶(MMP-3/7/10/11)可降解FN、LN和Ⅲ、Ⅳ型胶原;(3)明胶酶(MMP-2/9)主要降解Ⅳ型胶原和明胶；(4)弹性蛋白酶(MMP-12)主要降解弹性蛋白和胶原蛋白；(5)膜型基质金属蛋白酶(MMP-14～17)降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原并活化MMP酶原；(6)其他(MMP-19/20)。

MMPs的调控主要通过转录水平、酶原激活及内源性抑制剂来调节[34]。生理情况下的MMPs表达水平很低，以无活性的酶原形式(pro-MMPs)存在；在炎性因子、生长因子及高糖环境等因素刺激下可诱导MMPs的表达。pro-MMPs活化是MMPs发挥生物学功能的关键环节，其被组织和血浆中的丝氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等去除前肽区后活化特异性的抑制因子TIMPs抑制MMPs的活化过程，一方面与pro-MMPs形成稳定的复合体阻碍酶原活化；另一方面与活化的MMP以1∶1结合，抑制其活性。

TIMPs是MMPs内源性的抑制剂，通过竞争结合MMP催化结构域活性中心的Zn2+，抑制MMPs的活性。TIMPs在各种细胞中均有表达，在人体中发现有4种，包括TIMP-1/2/3/4：

TIMP-1主要由肾小管系膜细胞、肾间质成纤维细胞等分泌，可抑制绝大多数MMPs；TIMP-2主要抑制MMP-2的活性；TIMP-3可抑制几乎所有的MMPs成员；TIMP-4在心脏中有较高转录水平，主要抑制MMP-2活性，阻止新生血管的形成[35]。肾脏中MMPs发挥抑制作用的主要是TIMP-1/2，TIMP-3仅特定细胞表达，认为是细胞分化终末期的标志。

明胶酶MMP-2和MMP-9过度表达时可破坏对肾小管基底膜(TBM)完整性而发生EMT[36]。UUO模型中，MMP-2+/+小鼠ECM的标志性蛋白α-SMA显著增加，而MMP-2-/-小鼠和米诺环素处理的MMP-2+/+小鼠中ECM的标志物表达减少[37]，对慢性肾病的犬进行肾活检发现MMP-2表达增加[38]，同种异体肾移植后出现的肾纤维化和肾萎缩(IF/TA)中发现pro-MMP-2/9活性呈上升趋势[39]，提示MMP-2/9在RIF中具有致病作用，抑制MMP-2/9可能有益。

4 小结

ECM的合成与降解由一个复杂的体系调控，这个过程中促纤维化的细胞因子活性增强和(或)降解酶系比例失衡，将导致ECM在肾间质过度沉积，进而形成RIF。目前，人们对ECM调控机制的认知并不完全，如ECM来源途径存在争议、各种细胞因子及其形成信号通路的作用机制尚未完全阐明。针对促纤维的细胞因子和降解酶系的作用节点，靶向治疗可能成为一个值得研究的方向，防治RIF的研究多集中在某一靶向的抑制剂上，单一靶向抑制只能限制某一细胞因子或其信号通路上的作用，而对其他的细胞因子和信号通路促进RIF形成的影响未深入探讨，为此，多途径靶向抑制剂的联合治疗可能是研究的一个新方向。