miR-150-5p 靶向 SIRT1 提高肝癌细胞系HepG2放疗敏感性

吴大平，徐 璐，吴焕良，郑文宏，郑小妹，谢文蕊

(1.儋州市人民医院 肿瘤科，海南 儋州 571700； 2.海南医学院第一附属医院 血液肿瘤科，海南 海口 570000)

肝癌(hepatocellular carcinoma)是中国常见的恶性肿瘤，肝癌患者常采用手术，辅以放化疗等方法进行治疗。近年来随着对精准放疗的普及和开展，放疗已经成为治疗肝癌的有效手段。但是，肝癌细胞对放疗的抵抗降低了放疗敏感性，限制放疗的广泛应用[1]。miR-150-5p是一种非编码内源性小RNA分子，miR-150-5p在肝癌细胞中表达降低，升高miR-150-5p的表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，机制可能与其下调GAB1和ERK1/2表达有关[2]。研究表明，miR-150-5p通过抑制ATK途径增强NK/T细胞淋巴瘤的放疗敏感性[3]。miR-150-5p与肝癌细胞的放疗敏感性的关系尚未见报道。SIRT1在肝癌细胞中过表达，抑制SIRT1的表达明显抑制肝癌细胞的增殖、凋亡、转移及化疗耐药性等[4]。SIRT1可增加肝癌细胞的抗辐射性，且在低氧环境下更明显[5]。SIRT1被证明是由多个小RNA调控的，但在肝癌中，miR-150-5p是否靶向SIRT1还未见相关报导。本研究以HepG2细胞为研究对象，探讨miR-150-5p靶向SIRT1对肝癌细胞放疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人肝癌细胞系HepG2(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；DMSO和RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich公司)；agomiR-NC、agomiR-150-5p、anta-agomiR-NC和anta-agomiR-150-5p的构建(上海吉玛制药技术有限公司)；SIRT1空载体及过表达载体(广州复能基因有限公司)；LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen公司)；BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；抗-Bax、-caspase-9、-Bcl-2、-SIRT1和-β-actin抗体(一抗)(Abcam公司)；抗IgG抗体(二抗)(Thermo Fisher Scientificals公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与放射抵抗型细胞株的建立：将放射敏感型HepG2细胞置于含10%胎牛血清和双抗(青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)的RPMI 1640培养基中，5% CO2、37 ℃培养箱中培养。放射抵抗型细胞株(RR-HepG2)的建立：采用分次放疗放射递增法诱导，使用剂量为5 Gy，剂量率为0.5 Gy/min的60Co照射HepG2细胞，至累计照射量达60Gy。

1.2.2 细胞分组与转染：实验首先分为空白对照组(control)、阴性对照组(转染agomiR-NC)组和miR-150-5p过表达组(转染agomiR-150-5p)；后续实验分为agomiR-NC组、agomiR-150-5p组、anta-agomiR-150-5p的阴性对照组(anta-agomiR-NC)、miR-150-5p沉默组(anta-agomiR-150-5p)。当HepG2细胞汇合度达到70%左右，参照说明书使用LipofectamineTM2000转染试剂。将agomiR-NC、agomiR-150-5p、anta-agomiR-NC或anta-agomiR-150-5p分别转染至HepG2细胞，继续培养6 h，弃掉转染培养基，加入常规培养基培养过夜，倒置荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-150-5p的表达水平：RNA提取试剂盒提取对数增殖期细胞总RNA，反转录为cDNA，荧光定量PCR仪进行RT-qPCR。反应参数为95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。以U6为miR-150-5p的内参基因，miR-150-5p的相对表达量采用 2-ΔΔCt方法计算，实验重复3次取平均值。引物序列：miR-150-5p：上游 3′-ACACTCCAGCTGGGTCTCCCAACCCTTGTACCA-5′，下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′；U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCA CGAATTTGCGT-3′。

1.2.4 克隆形成实验检测放射敏感性：梯度倍数稀释法将HepG2、RR-HepG2细胞稀释至1×104个/mL。按照照射剂量的增加接种不同数量的细胞孵育过夜，转染24 h后，给予(0、2、4、6和8 Gy)照射。细胞每3 d换液，培养10～14 d，弃去培养基，PBS清洗2次；每孔加入400 μL快速Giemsa染液试剂固定2 min；然后，每孔加入800 μL Giemsa染液试剂染色8 min，流水冲洗染色液，自然干燥。光镜下观察≥50个细胞的集落，克隆形成率(planting efficiency，PE)=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数(survial fraction，SF2)=照射剂量组的集落数/(该组细胞接种数×未照射组PE)。采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线，SF=1-(1-e-D/D0)N，Dq=D0×lnN。其中D为照射剂量(Gy)，D0为平均致死剂量，Dq为准阈剂量(代表存活的宽肩度)，N为外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)=单纯照射组D0/联合照射组D0。以3次照射的存活分数进行均数分析，使用Grephpad Prime 6.0绘制存活曲线及单机多靶模和L-Q线性模型曲线拟合，求出D0、Dq、N、SF2、k值，放射增敏比SER。

1.2.5 双荧光素酶报告基因法检测miR-150-5p对SIRT1的靶向调控：TargetScan数据库显示SIRT1 3′UTR区域有miR-150-5p结合位点。构建野生型(WT)和突变型(MUT)SIRT1的3′UTR荧光素酶表达载体，取对数生长期HepG2细胞接种于24孔板(1×103个/孔)，待细胞增殖至80%汇合时，用LipofectamineTM2000分别将agomiR-NC、agomiR-150-5p、anta-agomiR-NC、anta-agomiR-150-5p质粒分别与SIRT1的野生型和突变型载体共转染至HepG2细胞中，依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶测定。实验结果以荧火虫(firefly luciferase)和海肾(renilla luciferase)荧光素酶活性的比值进行统计学分析。实验重复3次。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：辐射后48 h收集细胞(1×106个/mL)，1 000 r/min 离心5 min，弃去培养基，PBS洗涤1次，弃去PBS；加入250 μL PBS重悬细胞，加入10 μL annexin V-EGFP和5 μL PI，混匀，室温避光孵育15 min，流式细胞仪检测。

1.2.7 Western blot检测SIRT1、Bcl-2、Bax、caspase-9蛋白表达：收集细胞(1×106个/mL)，提取细胞中总蛋白，取100 μg蛋白进行变性，SDS-PAG电泳分离，湿转至PVDF膜上，封闭1 h，一抗以1︰500稀释后4 ℃孵育过夜，二抗孵育1 h，ECL显影液A和B液等体积混合滴于PVDF膜上，AI600成像系统显影，Image J软件进行吸光度值分析，以β-actin为内参进行吸光度值比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 放射敏感型与放射抵抗型肝癌细胞在不同剂量放射处理后miR-150-5p的表达量

RR-HepG2与亲代HepG2接受不同剂量放射处理，在相同放射剂量下，RR-HepG2组miR-150-5p的表达量均显著低于HepG2组(P<0.05)(表1)。

表1 放射敏感型与放射抵抗型肝癌细胞在放射处理后miR-150-5p的表达量Table 1 miR-150-5p expression in HepG2 and RR-HepG2 cells treated with

*P<0.05 compared with HepG2 group.

2.2 miR-150-5p促进辐射诱导的肝癌细胞HepG2存活分数降低

放射处理后，与对照组、agomiR-NC组比较，agomiR-150-5p组的细胞存活分数显著降低(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with ago miR-NC group图1 各组HepG2细胞经不同剂量辐射处理后的细胞存活分数Fig 1 Surviving cell fractions in the HepG2 cells of the 3 groups after radiation at different

根据单机多靶模型，计算所得各组D0、Dq、N、SF2和k值及增敏比见表2。

2.3 miR-150-5p促进辐射诱导的肝癌细胞HepG2凋亡

4 Gy放射处理后，agomiR-150-5p组凋亡相关蛋白Bax、caspase-9蛋白表达水平明显高于对照组和agomiR-NC组，Bcl-2蛋白表达水平明显低于对照组和agomiR-NC组(P<0.05)(图2，表3)。流式细胞仪检测显示，agomiR-150-5p组细胞凋亡率显著高于对照组和agomiR-NC组(图3，表3)。

表2 各组HepG2细胞的辐射敏感度参数(单机多靶模型)Table 2 Radio sensitivity parameters of HepG2 cells in the 3 groups

D0.mean lethal dose; Dq.quasi-domain; N.extrapolation number; SF2.survival fraction at 2 Gy; k.slope of the straight-line portion of the survival curve; SER.sensitization enhancement ratio.

图2 Western blot检测辐射处理后肝癌细胞HepG2凋亡相关蛋白表达量Fig 2 Western blot analysis of the expression of apopto- sis related proteins in HepG2 cells after radiation treatment

表3 miR-150-5p增强了辐射诱导的肝癌细胞HepG2凋亡Table 3 miR-150-5p enhances the apoptosis of HepG2 cells after radiation treatment(radiation dose: 4

*P<0.05 compared with agomiR-NC group.

2.4 miR-150-5p靶向SIRT1抑制SIRT1蛋白的表达

与agomiR-NC组比较，野生型(WT)agomiR-150-5p荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与anta-agomiR-NC比较，野生型(WT)anta-agomiR-150-5p荧光素酶活性显著升高(P<0.05)(图4，表4)。Western blot结果显示，与agomiR-NC组比较，SIRT1蛋白水平显著降低(P<0.05)；与anta-agomiR-NC比较，anta-agomiR-150-5p组SIRT1蛋白水平显著升高(P<0.05)(图5，表5)，提示miR-150-5p对SIRT1 具有负性调控作用。

图4 miR-150-5p与SIRT1的3′UTR结合位点Fig 4 Binding site of miR-150-5p and the 3′UTR of SIRT1

表4 双荧光素酶活性检测肝癌HepG2细胞miR-150-5p与SIRT1的靶向关系Table 4 Luciferase activity analysis of the targeted relationship of miR-150-5p and SIRT1

*P<0.05 compared with agomiR-NC group；#P<0.05 compared with anta-agomiR-NC group.

图5 Western blot检测肝癌HepG2细胞中SIRT1蛋白的表达Fig 5 Western blot analysis of expression of SIRT1 in HepG2 cells

表5 Western blot检测miR-150-5p过表达或敲除表达对肝癌HepG2细胞SIRT1蛋白表达的影响Table 5 Western blot analysis of the effect of miR- 150-5p on the expression of SIRT1 in HepG2

*P<0.05 compared with agomiR-NC group；#P<0.05 compared with anta-agomiR-NC group.

表6 各组HepG2细胞的辐射敏感度参数(单机多靶模型)Table 6 Radiosensitivity parameters of the HepG2 cells in 4 groups

D0.mean lethal dose; Dq.quasi-domain; N.extrapolation number; SF2.survival fraction at 2 Gy; k.the slope of the straight-line portion of the survival curve; SER.sensitization enhancement ratio.

2.5 miR-150-5p通过调控SIRT1提高肝癌细胞的放疗敏感性

放射处理后，与agomiR-NC组比较，agomiR-150-5p组的细胞存活分数显著降低(P<0.05)(图6)，与agomiR-150-5p+vector组比较，agomiR-150-5p+SIRT1组的细胞存活分数显著升高(P<0.05)。根据单机多靶模型，计算各组D0、Dq、N、SF2、k值及增敏比(表6)。4 Gy放射处理后，与agomiR-NC组比较，agomiR-150-5p 组Bax、caspase-9蛋白表达水平显著升高，Bcl-2蛋白表达水平显著降低；与agomiR-150-5p+vector组比较，agomiR-150-5p+SIRT1组Bax、caspase-9蛋白表达水平显著降低，Bcl-2蛋白表达水平显著升高(图7，表7)。

*P<0.05 compared with agomiR-NC group；#P<0.05 compared with agomiR-150-5p+vector group图6 各组肝癌细胞HepG2经不同剂量辐射处理后的克隆形成存活分数Fig 6 Surviving cell fractions in the HepG2 cells of the 4 groups after radiation at different doses

图7 Western blot检测辐射处理后肝癌细胞HepG2凋亡相关蛋白表达量Fig 7 Western blot analysis of the expression of apoptosis-related proteins in HepG2 cells after radiation treatment

3 讨论

肝癌是中国常见的恶性肿瘤，其恶性程度高，易复发，病死率高，治疗方式主要包括手术、化疗、放疗[6]。但肝癌细胞对放疗的抵抗限制了其疗效， 提提高肝癌放疗敏感性对肝癌的治疗具有重要临床意义。miRNA是一类非编码小RNA，在肿瘤发生中发挥重要作用[7]。研究显示，低表达miR-150-5p的三阴性乳腺癌患者生存时间缩短，且对化疗的敏感性降低[8]。本研究结果显示，相同放射剂量下，miR-150-5p在放射抵抗型RR-HepG2细胞中的表达量显著低于HepG2细胞，有报道，过表达miR-150对NK/T细胞淋巴瘤有辐射增敏作用[9]。还有报道，miR-150通过负性调节GAB1-ERK1/2轴抑制肝癌细胞的增殖、侵袭、转移能力[2]。本研究结果显示，过表达miR-150-5p可抑制肝癌细胞的存活，提高放疗敏感性。

表7 miR-150-5p通过调控SIRT1增强辐射诱导的肝癌细胞HepG2凋亡Table 7 miR-150-5p enhanced the apoptosis of HepG2 cells after radiation treatment by regulating SIRT1

*P<0.05 compared with agomiR-NC group；#P<0.05 compared with agomiR-150-5p+vector group.

Bcl-2家族在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Bcl-2为抗凋亡蛋白，Bax为促凋亡蛋白，当Bax表达过量可抑制Bcl-2的凋亡抑制作用促进细胞凋亡[10]。Caspase-9是凋亡的关键执行者，其能裂解底物促进细胞凋亡[11]。本研究显示，过表达miR-150-5p、Bax和caspase-9蛋白表达水平显著升高，Bcl-2水平显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示miR-150-5p可能通过改变Bax和Bcl-2表达，激活caspase-9，促进细胞的凋亡。

SIRT1参与细胞的增殖、凋亡、转移及化疗耐药性等[12]。SIRT1基因沉默明显提高了DLBCL细胞的放射敏感性[13]，且SIRT1受多种miRNA的调控，miR-204-5p靶向抑制SIRT1的表达促进肝癌细胞的凋亡，提高药物敏感性[14]。miR-22通过靶向SIRT1抑制肿瘤发生并改善乳腺癌细胞的放射敏感性[15]。本研究中过表达miR-150-5p后，细胞的存活分数降低，细胞增敏比升高，SIRT1过表达逆转了过表达miR-150-5p对细胞的凋亡抑制作用以及降低了细胞增敏比。提示miR-150-5p提高放疗敏感性，促进细胞的凋亡可能是通过负向调控SIRT1实现的。

综上所述，miR-150-5p通过负向调控SIRT1的表达，可提高肝癌细胞放疗敏感性，为肝癌分子靶向治疗提供理论依据。但本研究尚存在不足之处，细胞信号通路较为复杂，关于miR-150-5p负向调控SIRT1的通路有待进一步深入研究。