电刺激促进大鼠脊髓钝挫伤后运动功能恢复

曾 茜，詹 琪，高 远，崔乃浩，冯鲁乾

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附属医院 神经外科， 贵州 贵阳 550004)

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种高致残率的中枢神经系统疾病,对家庭以及社会的稳定性有恶性影响力[1-2]。SCI后神经的修复和运动的改善主要还是在于保护残存神经元以及正向调节神经元的可塑性[3]，但是神经电刺激在关于保护神经元以及调控神经元可塑性的研究较少。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)由星形胶质细胞分泌，对神经元的存活、再生有重要作用[4]，巢蛋白(nestin) 是一种中间丝蛋白,多出现于中枢神经系统发育的早期阶段，目前研究表明nestin表达与轴突再生和神经可塑性呈相关性[5]。为此，本实验复制脊髓钝挫伤(spinal cord contusion,SCC)大鼠模型，采用神经电刺激在计划的时间点进行干预，应用免疫组织化学染色技术及蛋白质印迹检测不同时段NGF与nestin表达的影响,以探讨NGF与nestin在运动功能恢复过程中的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠 90只，雌性，220～250 g[成都达硕实验动物有限公司提供, 合格证号：SYXK(川)2014-189]。

1.1.2 主要实验试剂以及仪器：兔SP试剂盒、羊血清(北京中杉金桥生物技术公司);NGF、nestin一抗(武汉博士德生物工程有限公司)；RIPA裂解液、ECL化学发光试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；SZD-II 型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠随机分为假手术组(n=6)、对照组(具体分为3、7和11 d组，每组n=6)和实验组(具体分为3、7和11 d组，每组n=6)，根据不同的观察技术亦可分为BBB评分(Basso, Beattie and Bresnahan Locomotor Rating Scale, BBB Sacle)组(n=18)、免疫组织化学染色技术组(n=36)和蛋白质印记组(n=36)，免疫组化组和蛋白质印记组分别在3、7和11 d取材。实验组与对照组以Allen’s法复制大鼠脊髓损伤模型，即腹腔注射3.6%水合氯醛麻醉大鼠(35 mg/kg)，俯卧位固定，在以神经节段T9处作为中心，依次切开皮肤、筋膜及肌肉，随后进行椎板切除术，暴露脊髓。选择10 g金属棒在30 mm处自由下落，实施脊髓钝挫伤(SCC)，然后依次关闭肌肉、筋膜和皮肤。假手术组只进行椎板切除术，不实施打击。

1.2.2 神经电刺激的干预：术后24 h对实验组进行电刺激干预，正极接在大鼠T7右侧“夹脊穴”位置的皮肤，负极接在右下肢 “足三里穴”位置的皮肤。干预参数为：每天1次，刺激频率10 Hz，疏密波脉冲电流，电流强度2.5 Hz，时长30 min。采用BBB评分法评估大鼠后肢运动情况。

1.2.3 免疫组织化学染色(immunohistochemistry，IHC)检测：在对应的时间点进行大鼠心脏灌注，固定脊髓组织后制备石蜡切片(5 μm)，按兔SP试剂盒说明书进行免疫组化染色：烤片、脱蜡、水化、抗原修复，3% H2O2(过滤0.01 mol/L PBS配制)37 ℃封闭10 min，5%羊血清(用过滤0.01 mol/L PBS配制)37 ℃孵育25 min，加一抗(NGF，兔抗，1∶200；nestin，兔抗，1∶200)4 ℃过夜，漂洗:依次加试剂B及试剂C孵育。DAB显色，0.01 mol/L PBS终止反应，复染、分色、反蓝、脱水、封片。采用Motic光学显微镜400×视野下观察不同组别以及不同时间点脊髓前角NGF和nestin阳性细胞分布并计数。

1.2.4 蛋白质印记(Western blot)检测：0.9%氯化钠溶液(4 ℃)快速心脏灌注后，以脊髓损伤点为中心取1 cm脊髓节段，加入RIPA裂解液常规研磨5 min，后在10 000 r/min离心15 min, 取上清在280 nm紫外光吸收法初步测定蛋白浓度，接着加入5×上样缓冲液，在100 ℃加热5 min以使蛋白质变性。组装电泳槽，点样50 μg/孔，(SDS-PAGE)电泳，到溴酚蓝接近玻璃板底部时关闭电源。取出胶块转膜，组装转膜槽，加电转缓冲液， 在300 mA条件下电转1.5 h。漂洗后5%羊血清封闭、一抗孵育4 ℃过夜。采用ECL化学发光试剂说明书进行底物显色,然后进行凝胶成像，进行吸光度值测量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 神经电刺激促进大鼠脊髓损伤后运动功能的恢复

与对照组相比，实验组运动功能评分(BBB Scale)在SCC 7 d后就明显上调(图1)(P<0.05)。

2.2 神经电刺激促进NGF和nestin阳性细胞的表达

与对照组相比，实验组SCI后3 d 脊髓前角NGF和nestin阳性细胞数均显著上调(P<0.05)，并且在7 d、11 d时NGF依旧呈强阳性表达(P<0.05)(图2,3，表1)。

*P<0.05 compared with control group图1 神经电刺激促进大鼠脊髓钝挫伤后的运动功能恢复Fig 1 Nerve electrical stimulation promoted motor function recovery of SCC rats

2.3 神经电刺激对NGF和nestin蛋白表达水平的影响

与对照组相比，实验组NGF在3 d表达迅速上调(P<0.05)，而且到11 d时实验组NGF蛋白表达依旧处于较高水平(P<0.05)。总体上，实验组nestin表达较对照组在3、7以及11 d均上调(P<0.05)(图4，表2)。

3 讨论

针刺疗法在传统中医中具有十分悠久的应用历史，本实验中取夹脊穴和足三里穴作为研究点。另有研究取穴水沟穴、阳陵泉、风府穴等穴位，发现针刺疗法具有抗感染、抗细胞毒性反应以及抗凋亡作用[6]。神经电刺激不仅是穴位刺激，更是一种电磁场效应，能调动机体脊髓损伤后的自我修复程序和调控网络，保护神经元，提高神经元的可塑性[7]。若将神经干细胞(neural stem cells，NSCs)放置于磁场中，可以发现nestin和Sox2的表达上调，而且还促进NSCs分化成神经元和星形胶质细胞/神经胶质细胞[8]，这种现象可能是由于磁场作用上调Wnt1和β-连环蛋白(β-catenin)，正向调控Wnt/β-catenin信号通路[9]，从而促进神经干/祖细胞分化、神经元增殖以及存活，这可能是本实验中神经电刺激改善脊髓钝挫伤大鼠的运动功能的机制。

Nestin一般在胚胎发育早期的神经上皮表达，若干/祖细胞分化成熟，nestin的表达会减弱甚至停止。但在成熟生物中，已经发现nestin在病理条件下上调，并且出现神经干细胞自我更新[10]。外界机械损伤导致神经系统损伤，可能是由于小胶质细胞活化，介导Jak/STAT信号通路，上调nestin的表达，从而影响祖细胞的增殖和分化[11]。本实验观察到神经电刺激促进nestin的表达，因此神经电刺激可提供了神经干/祖细胞更新或者增殖的微环境，在源头上保证了神经元存活的数量。

A.expression of NGF in control group at 3 days; B.expression of NGF in control group at 7 days; C.expression of NGF in control group at 11 days; D.expression of NGF in experiment group at 3 days; E.expression of NGF in experiment group at 7 days; F.expression of NGF in experiment group at 11 days; Arrows indicated NGF positive products图2 神经电刺激促进脊髓前角NGF的表达Fig 2 Nerve electric stimulation promoted the expression of NGF in the anterior horn of the spinal cord (×400)

A.expression of nestin in control group at 3 days; B.expression of nestin in control group at 7 days; C.expression of nestin in control group at 11 days; D.expression of nestin in experiment group at 3 days; E.expression of nestin in experiment group at 7 days; F.expression of nestin in experiment group at 11 days; Arrows indicated nestin positive products图3 神经电刺激促进脊髓前角nestin的表达

groupNGFnestin3days7days11days3days7days11dayscontrol5.20±0.8312.18±0.577.16±1.2113.60±1.5223.60±0.897.20±1.84experiment12.40±1.14∗21.19±1.23∗11.58±0.91∗23.40±1.82∗35.20±1.48∗11.40±1.67∗

*P<0.05 compared with control group.

图4 神经电刺激对NGF和nestin蛋白表达水平的影响Fig 4 Effect of nerve electrical stimulation on the expression levels of NGF and nestin

表2 神经电刺激对脊髓NGF和nestin蛋白相对表达水平的影响Table 2 Effects of nerve electric stimulation on NGF and nestin protein level in the spinal

*P<0.05 compared with control group.

NGF作为经典的神经营养素家族一员，主要通过与原肌球蛋白受体激酶A受体(Trk A)和泛神经营养因子受体(p75NTR)结合持续发挥生物学效应[12]。在本实验中，神经电刺激上调NGF的表达，可能是电磁场效应激活了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)，Ras /丝裂原活化蛋白激酶(Ras / MAPK)和磷脂酶C-γ(PLC-γ)信号通路，促进轴突生长和调节神经元可塑性。

总之，本实验结果表明神经电刺激能促进NGF和nestin的表达，可能促进神经存活和神经可塑性，从而在大鼠后肢运动功能中起重要作用。