水蒸气蒸馏法提取澳洲坚果叶精油工艺

何凤平，雷朝云，范建新，康专苗，刘荣，韩树权

贵州省农业科学院亚热带作物研究所（兴义 562400）

澳洲坚果（Macadamia internifolia）亦称夏威夷果，为山龙眼科澳洲坚果属的多年生常绿果树，原种植于澳大利亚昆士兰州东南部沿海地区及新南威尔士州东北部沿岸的亚热带雨林地区[1-2]。目前，澳大利亚、南非、美国、中国等为其主要栽培国家，在我国的广东、云南、广西、贵州、四川等地均有种植[2-3]。近年来，澳洲坚果发展十分迅猛，应用前景相当广阔，吸引众多国内外学者在栽培和品质方面作了深入的研究，然而集中于澳洲坚果其他方面的国内外研究相当少，尤其是枝叶方面的报道更是微乎其微，当前仅有的少数研究均是关于其叶面积的测定[4-6]。

目前，贵州省乃至全国各地均是将澳洲坚果枝叶修剪之后丢弃在地，任其腐烂当作自身的肥料或是回收至家焚烧取暖，既污染空气，又未发挥出它自身的最大价值，严重不符合可持续发展的理念。有前期试种研究发现，贵州省南北盘江、红水河流域海拔1 000 m以下、赤水河流域海拔650 m以下等地区均适宜种植澳洲坚果，贵州适宜种植面积在9.87万 hm2以上，种植推广空间巨大[7]。目前贵州现有澳洲坚果栽培面积约1 333 hm2，全国13.33万 hm2以上，每年修剪遗弃的澳洲坚果叶片不计其数。随着产业的不断发展，意味着修剪遗弃掉的澳洲坚果叶片将越来越多，急需为修剪遗弃的澳洲坚果叶寻找出路，做出适宜处理以使它价值最大化，从而变废为宝。

精油是存在于植物体内（如：花、果实、叶、根、皮等）的一类可随水蒸气蒸馏且具有一定气味的挥发性油状液体的总称，属植物体自身的次级代谢产物，享有“液体黄金”的美誉。国内外众多的研究均表明，植物精油是由多种成分组合的天然混合物，具有抗氧化、抑菌、保鲜等作用，广泛应用于化妆品、洗涤用品、食品（果蔬及肉类）、烟酒以及其他工业用香精中[8-15]。目前植物精油提取方法有很多，例如水蒸气蒸馏法、分子蒸馏法、同时蒸馏萃取法、有机溶剂萃取法、超临界二氧化碳流体萃取法、亚临界水萃取法、微胶囊-双水相萃取法、超声微波辅助提取法等[8,16-17]，其中水蒸气蒸馏法因设备简单、操作简便、提取成本低等优点应用广泛，同时也是植物精油提取最为常用的方法[18-19]。

迄今国内外有大量植物精油相关的研究报道，但其中却鲜有关于澳洲坚果叶片提取精油的报道。前期预试验发现能从澳洲坚果叶片中提取出精油，但方法还需要不断改进和优化，从而达到变废为宝、提高澳洲坚果附加值的目的，进一步促进澳洲坚果产业健康绿色发展。因此，研究通过单因素试验（浸泡时间、料液比、NaCl质量浓度和蒸馏时间）和正交试验来确定水蒸气蒸馏法提取澳洲坚果精油的最佳工艺条件，旨在为澳洲坚果叶的相关研究提供理论参考及依据，同时对于澳洲坚果叶的开发利用也具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

澳洲坚果鲜叶，采摘于贵州省农业科学院亚热带作物研究所基地，根据叶片的色泽及形态挑选成熟的叶片采摘。

NaCl，购自成都金山化学试剂有限公司，分析纯；无水乙醇，购自天津市富宇精细化工有限公司，分析纯。

蒸馏装置（1 000 mL）；JM-B 5003型电子天平，余姚纪铭称重校验设备有限公司；艾柯超纯水机，成都唐氏康宁科技发展有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 前处理方法

将采摘的澳洲坚果鲜叶运回实验室，挑选新鲜、无病虫害的叶片洗净，自然晾干叶片表面水分待用。精油提取之前去掉叶片的叶柄，然后剪成1～2 cm2的碎片备用。

1.2.2 提取方法

澳洲坚果鲜叶精油提取采用水蒸气蒸馏法，以《中华人民共和国药典》中挥发油提取方法为参照[20]。准确称取澳洲坚果碎叶片50.00 g，装入到1 000 mL的圆底烧瓶中，然后按照试验设计中的料液比加入蒸馏水，改变浸泡时间、NaCl质量浓度和蒸馏时间，连接好蒸馏装置开始进行不同条件下的蒸馏。第一滴液滴滴出时开始计时，蒸馏结束之后，采用油水分离器分离精油，收集精油称质量，计算精油提取率。

1.2.3 精油提取率计算

1.2.4 单因素试验设计

1.2.4.1 浸泡时间对澳洲坚果精油提取率的影响

准确称取5份澳洲坚果碎叶片50.00 g，分别按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室温条件下浸泡0，2，4，6和8 h，蒸馏提取2 h之后，采用油水分离器分离精油，收集精油称质量，计算精油提取率，确定澳洲坚果精油提取的最理想浸泡时间。

1.2.4.2 料液比对澳洲坚果精油提取率的影响

准确称取5份澳洲坚果碎叶片50.00 g，分别按照1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室温条件下浸泡2 h，蒸馏提取2 h之后，采用油水分离器分离精油，收集精油称质量，计算精油提取率，确定澳洲坚果精油提取的最佳料液比。

1.2.4.3 NaCl质量浓度对澳洲坚果精油提取率的影响

准确称取5份澳洲坚果碎叶片50.00 g，分别按照1∶5（g/mL）的料液比加入0，2.5，5，7.5和10 g/100 mL的NaCl溶液，在室温条件下浸泡2 h，蒸馏提取2 h之后，采用油水分离器分离精油，收集精油称质量，计算精油提取率，确定澳洲坚果精油提取的最适宜NaCl质量浓度。

1.2.4.4 蒸馏时间对澳洲坚果精油提取率的影响

准确称取5份澳洲坚果碎叶片50.00 g，分别按照1∶5（g/mL）的料液比加入2.5 g/100 mL的NaCl溶液，在室温条件下浸泡2 h，蒸馏提取1，2，3，4和5 h之后，采用油水分离器分离精油，收集精油称质量，计算精油提取率，确定澳洲坚果精油提取的最合适蒸馏时间。

1.2.5 正交试验设计

以澳洲坚果精油提取率为指标，在单因素试验基础上，选取料液比、NaCl质量浓度和蒸馏时间作为主要因素设计正交试验，确定澳洲坚果精油提取的最佳工艺条件。正交试验因素水平设计表见表1。

表1 澳洲坚果叶精油提取正交试验因素水平设计表

1.2.6 澳洲坚果精油最佳提取工艺条件验证

在正交试验中得出的最佳提取工艺条件下，按照1.2.2项中的方法进行精油提取，重复5次，计算澳洲坚果叶精油提取率平均值，与正交试验中的精油提取率最大值进行比较，验证正交试验是否有效。

1.2.7 数据分析及处理

各指标测定均重复3次。运用Excel 2007和SPSS 17.0软件进行数据处理及分析，Sigma Plot 12.0绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 浸泡时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响

由图1可知，浸泡时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响效果不太明显，在其他条件一定的情况下，随着浸泡时间的延长，澳洲坚果叶精油提取率增加幅度不大。在浸泡2 h之后，精油提取率还存在稍微降低的趋势，可能原因在于浸泡时间过长，澳洲坚果叶中部分精油也许会溶于水中，另外或许是因为澳洲坚果叶中某些能产生乳化作用的成分溶出而抑制精油被蒸出，最终导致其精油提取率降低[21-23]。因此，综合精油提取率、时间成本等因素，选择浸泡时间2 h为宜。

2.1.2 料液比对澳洲坚果叶精油提取率的影响

在植物精油提取中，料液比是一个较为重要的影响因素。由图2可知，随着料液比增加，澳洲坚果叶精油提取率逐渐上升，在料液比为1∶5（g/mL）时，澳洲坚果叶精油提取率达到最大值，原因在于：一是随着料液比的增加，蒸汽释放速率会提高，从而对精油的携带能力会增强，致使精油提取率增大[24]；二是对于固定质量的原料来讲，添加进去的水量增多，精油浓度会随之降低，使得精油与水接触面处的浓度差反而会增大，可提髙传质速率，同时还能让原料得到充分地浸泡，细胞更容易破裂，精油也更易渗透出来，从而可在一定程度上增加精油提取率[18,21,25]。当料液比继续增大，精油提取率却呈现出缓慢下降的趋势，主要是由于蒸汽所携带出的精油量在增多，而冷凝回收的效率却在降低[24]。因此，在一定的冷凝效果及固定质量的原料条件下，适宜的料液比对精油提取率有很大的影响，综合精油提取率、节能等方面考虑，料液比选择1∶5（g/mL）为宜。

图1 浸泡时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响

图2 料液比对澳洲坚果叶精油提取率的影响

2.1.3 NaCl质量浓度对澳洲坚果叶精油提取率的影响

NaCl在整个蒸馏过程中主要起到盐析的作用[26]。在水蒸气蒸馏法提取植物精油过程中，加入适量的NaCl之后，可以极大程度地提高精油提取率，主要是因为一定质量浓度的NaCl溶液可以改变植物组织细胞的渗透压，促使细胞破裂，让位于细胞内的精油可以更多地渗透出来，同时NaCl还能降低精油在水中的溶解度，从而使得精油更容易被蒸出[25]。由图3可知，随着NaCl质量浓度增加，澳洲坚果叶精油提取率升高，NaCl质量浓度为2.5 g/100 mL时达到最大值；随后NaCl质量浓度增大，澳洲坚果叶精油提取率反而呈现出不断下降的趋势。综合精油提取率、节能等方面考虑，NaCl质量浓度选择2.5 g/100 mL较为合理。

图3 NaCl质量浓度对澳洲坚果叶精油提取率的影响

2.1.4 蒸馏时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响

水蒸气蒸馏法提取植物精油，若蒸馏时间太短，水分将不能充分地浸入到植物组织的各个部位，导致精油不能完全被提取出来，从而使得提取率降低。通过延长蒸馏时间可以更彻底地将精油提出，获得较为理想的提取效果，但是蒸馏时间若过长，将会浪费掉很多资源，同时在蒸馏后期蒸汽量太大反而还会致使少部分精油损失[24-25]。由图4可知，随着蒸馏时间的延长，澳洲坚果叶精油提取率逐渐增大，当蒸馏时间为4 h时，澳洲坚果叶精油提取率达到最大值；随后呈降低的趋势。综合精油提取率、节约能耗及时间成本等方面考虑，蒸馏时间宜选择4 h。

图4 蒸馏时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响

2.2 澳洲坚果叶精油提取工艺的正交试验结果及方差分析

由各因素的单因素试验结果得知，料液比、NaCl质量浓度和蒸馏时间对澳洲坚果叶精油提取率的影响最大，由此确定料液比、NaCl质量浓度和蒸馏时间为影响澳洲坚果精油提取率的主要因素，为确定其最佳提取工艺条件，设计了正交试验。以精油提取率为指标，进行L9(34)正交试验，得出水蒸气蒸馏法提取澳洲坚果叶精油的最佳工艺条件，其中加入空白列的目的在于能更好地检验是否存在对试验结果有重要影响的因子被遗漏[18]。

极差R越大表明该因素对精油提取率的影响就越大[18]。从表2中可知，极差分析结果显示RA＞RC＞RB，由此可得知各因素对澳洲坚果叶精油提取率影响程度大小排序为A＞C＞B，即料液比＞蒸馏时间＞NaCl质量浓度。正交试验结果中的提取率越大表明精油提取效果越好，以澳洲坚果叶精油提取率为指标，选择k1、k2、k3中最大值对应的水平为最佳提取工艺因素水平。综合分析得出，水蒸气蒸馏法提取澳洲坚果叶精油的最佳工艺条件为A3B2C2或A3B2C3，由于考虑成本因素，选择A3B2C2，即料液比1∶5（g/mL）、NaCl质量浓度2.5 g/100 mL、蒸馏时间3 h。

表2 澳洲坚果叶精油提取工艺的正交试验结果及极差分析表

澳洲坚果叶精油正交试验效应曲线见图5。图中各因素对提取率影响变化趋势同单因素试验中基本一致。

图5 澳洲坚果叶精油正交试验效应曲线

2.3 澳洲坚果叶精油提取工艺条件验证结果

为考察上述最佳工艺条件的稳定性，按照正交试验得出澳洲坚果叶精油的最佳提取条件：料液比1∶5（g/mL）、NaCl质量浓度2.5 g/100 mL、蒸馏时间3 h、重复5次。计算得出精油提取率平均值为1.061%，与正交试验中的精油提取率最大值1.067%极为接近，说明正交优化试验有效。

表3 澳洲坚果叶精油提取工艺条件验证结果表

3 结论

研究中，在单因素试验基础上，进行了正交试验，综合单因素试验结果和正交试验结果，分析得到水蒸气蒸馏法提取澳洲坚果叶精油的最佳工艺条件为料液比1∶5（g/mL）、NaCl质量浓度2.5 g/100 mL、蒸馏时间3 h。通过极差分析得出，各因素对澳洲坚果叶精油提取率的影响程度大小排序为料液比＞蒸馏时间＞NaCl质量浓度。