脑卒中出血转化的风险评估与实验室辅助诊断*

谢凤欣，靳伟东，张东云，田晖艳，府伟灵 综述，张 阳 审校

(1.陆军军医大学第一附属医院检验科，重庆 400038；2.重庆市人民医院检验科，重庆 400013)

脑卒中是人类的多发病，在西方国家的疾病死因统计中位居第三，仅次于心脏病和肿瘤[1]。随着我国人口老龄化的快速发展，脑卒中已成为我国第一位的死亡病因，并以每年8.7%的速度上升，其中缺血性脑卒中(脑梗死)约占78%[2]。目前，急性缺血性脑卒中最有效的治疗方法是溶栓治疗，但溶栓后带来的出血转化是溶栓治疗的严重并发症，可使病情恶化，危及患者的生命安全和导致不良预后，影响静脉溶栓治疗的安全性和有效性[3]。同时，抗凝和抗血小板聚集治疗也会增加出血转化的风险。因此，提前预估患者的出血风险，选择合理的治疗手段和用药剂量显得尤为重要。

1 脑卒中与出血转化

1.1出血转化的定义及临床诊断 出血转化是发生于急性缺血性脑卒中后，梗死区内出现继发性岀血的现象，是缺血性脑卒中溶栓治疗后最常见的并发症。流行病学调查显示，继发性出血转化的发生率为8%～48%，其中因溶栓治疗后出血转化发生率为2%～7%[4]。出血转化的临床诊断标准是首次脑CT检查未发现出血，而复查脑CT或MRI时发现颅内出血。使用抗凝、抗血小板药物，以及溶栓和血管内操作等均会增加出血转化的发生频率和严重程度[5]。

临床确诊出血转化主要依靠脑CT与MRI检查。自发性出血转化一般出现在脑梗死后36 h至1个月不等，溶栓所致出血转化大多发生在36 h内。对于出血转化高风险的溶栓患者需要严密监测神经症状和生命体征，积极安排影像学检查。临床上出血转化的分型主要基于影像学表现，目前多使用欧洲急性卒中协作研究(ECASS)分型方法[6]，根据出血形态和部位，出血转化分为：出血性脑梗死(HI) 1 型，梗死灶边缘的小斑点状出血；HI 2 型，梗死范围内的片状出血灶，但没有占位效应；脑实质出血(PH)1 型，血肿≤30%的梗死面积，伴轻微占位效应；PH 2 型，血肿>30%的梗死面积，伴明显占位效应[7]。另外，根据病理特点出血转化还可以分为毛细血管型和小动脉型。

1.2出血转化的相关实验室检查 目前，国内外指南推荐治疗缺血性脑卒中最有效的方法是重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓，然而静脉溶栓带来的出血转化是治疗中最严重的并发症。出血转化是一个动态且复杂的过程，具体机制尚未阐明。既往研究认为，缺血性脑卒中后血-脑屏障的破坏、梗死区再灌注损伤是重要的诱因。缺血时间越长，通过再灌注损伤血-脑屏障越严重，出血转化风险就会越高[8]。对脑卒中患者应进行动态实验室检查，以密切监测凝血及生理状态。常规实验室检查如下：(1)血糖，肝、肾功能和电解质；(2)心电图和心肌缺血标志物；(3)全血计数，包括血小板计数；(4)凝血酶原时间(PT)、国际标准化比率(INR)和活化部分凝血活酶时间(APTT)；(5)氧饱和度等[9]。其中，凝血功能的检测尤为重要。脑梗死急性期时，凝血系统功能被激活，血液处于高凝状态，容易继发形成血栓，监测凝血功能可作为评估机体血栓形成倾向的重要指标。定期监测凝血指标PT、INR、APTT对指导溶栓治疗，及时调整剂量有着重要的临床意义。

2 分子诊断助力脑卒中个体化用药指导

近年来，随着溶栓、抗栓等药物在临床的使用，抗凝药物诱发出血的发生率也在逐年上升，而其中以抗凝药物相关脑出血(AAICH)及溶栓后出血转化尤为常见。随着药物基因组研究的发展，抗凝药物相关出血的遗传学机制和相应的检测技术也逐渐成为研究热点。多项研究表明，药物代谢相关基因的单核甘酸多态性(SNP)与个体所需用药剂量有关，并与抗凝药物使用过程中抗凝不足或者出血等不良反应的发生相关。抗凝药物基因主要可以分为两类，首先是与药物代谢和作用靶点相关的基因，如细胞色素P4502C9(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)等；其次是与体内维生素K1代谢循环相关的基因，如GGCX、CYP4F2、ApoE等。

2.1基因多态性检测与抗凝药物的选择 华法林是用于预防血栓栓塞性疾病最广泛的抗凝药物，主要适用于静脉血栓和肺栓塞患者。若华法林使用得当，可达到预防血栓形成和预防脑卒中的效果，若未能合理使用华法林，则会导致患者发生脑出血、消化道大出血等严重不良后果。华法林服用剂量因人而异，维持同样的抗凝血效果日服剂量可能相差20多倍。因此，服药期间患者必须监测凝血机制中PT和INR，并根据凝血功能指标调整药物剂量。近年来，有学者发现华法林相关基因CYP2C9、VKORC1等基因的多态性与华法林个体剂量和抗凝效果有关[10]。

CYP2C9是编码细胞色素P450酶2C9的基因，华法林在体内由2C9酶代谢。CYP2C9基因突变会造成华法林代谢能力降低。目前报道最多的SNP是野生型CYP2C9*1、突变型CYP2C9*2 (rs1799853)和突变型CYP2C9*3(rs1057910)，具有两种突变的人群代谢华法林的能力明显下降，对华法林会更加敏感，出血不良反应也会增加[11]。CYP2C9等位基因的分布存在种族差异，亚洲人CYP2C9基因突变率明显低于高加索人和黑种人。但是亚洲人需服用华法林平均维持剂量却比白种人和黑种人低，要达到同等水平的凝血效果，白种人的平均剂量约为4.5 mg/d，黑种人约为5.7 mg/d，而亚洲人为3.0 mg/d[12]。这一现象说明CYP2C9基因并不是唯一造成种族间华法林剂量差异的基因。

VKORC1是编码维生素K环氧化物还原酶复合体1的基因，是维生素K代谢循环中的限速酶。VKORC1基因多态性与华法林用药剂量也有着密切关系，且在初始阶段对华法林剂量的影响高于CYP2C9。一项回顾性分析研究表明，VKORC1-1639G/A基因多态性与华法林维持剂量相关，携带1639GG基因型的人群比1639AA型人群日平均所需华法林剂量高61%[13]。中国人群中VKORC1-1639A等位基因频率超过90%，而高加索人的等位基因频率仅为38.79%[12]，这可能是导致中国人华法林平均维持剂量低于白种人的原因之一。

2.2基因多态性与抗血小板药物 心脑血管疾病的二级预防和部分脑栓塞的患者均需要抗血小板治疗。氯吡格雷和阿司匹林是目前应用最为广泛的抗血小板药物。但患者对抗血小板药物的药效具有个体差异，5%～45%的患者服用阿司匹林无效，4%～30%的患者服用氯吡格雷无效，不但影响治疗效果，也会增加药物不良反应[14]。目前临床上常用血小板聚集试验、床边快速检测法和platelet works法来检测抗血小板药物疗效，越来越多的研究表明，遗传倾向明显影响药物的药代动力学和药效学，从而改变药物反应[15]。

氯吡格雷是一种需要通过肝细胞色素P450转化为活性代谢产物才能发挥血小板抑制功能的前体药物。CYP2C19是细胞色素P450家族中最重要的药物代谢酶之一，许多内源性底物及临床上大约2%的药物都由其催化代谢。CYP2C19基因多态性能影响氯吡格雷的代谢水平，其中CYP2C19*2、CYP2C19*3位点的突变频率较高，与氯吡格雷抵抗的发生有关[16]。CYP2C19基因野生型为CYP2C19*1/*1型，中国人群中较常见的等位基因型是CYP2C19*2型、CYP2C19*3型和CYP2C19*17型，其中CYP2C19*2型和CYP2C19*3型可引起CYP2C19基因编码的酶活性减弱，代谢底物的能力减弱，造成活性代谢产物不能生成，导致氯吡格雷抵抗，此基因型携带者称为弱代谢者。CYP2C19*17型可引起CYP2C19基因编码的酶活性增强，代谢底物的能力增强，此基因型携带者称为强代谢者。2010年美国食品和药品管理局(FDA)要求在氯吡格雷药物标签上注明CYP2C19与疗效的关系，并建议使用前检测CYP2C19基因的多态性来指导医生选择用药剂量[17]。ABCB1基因多态性在氯吡格雷抵抗中也起着重要作用，携带ABCB1基因TT纯合子相比野生型有更高的心血管事件发生率[18]。

阿司匹林通过抑制血栓素A2(TXA2)的合成从而对血小板的激活和聚集起到抑制作用。基因多态性在阿司匹林抵抗中起着重要作用，主要包括环氧合酶(COX)、二磷酸腺苷(ADP)受体、胶原受体、血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)等基因。COX是合成前列腺素的限速酶，阿司匹林的作用机制主要是抑制COX的活性。有研究发现，COX-1基因A842G位点的SNP与阿司匹林抵抗发生有关，AG和GG基因型的患者更容易发生阿司匹林抵抗，且会增加心血管不良事件的风险[19]。ADP受体(P2Y1和P1Y12)是血小板聚集的重要介质，P2Y1和P1Y12的表达高低都会影响血小板的聚集率，P2Y1上的rs701265GG基因型会增加阿司匹林抵抗的危险性。GPⅠa/Ⅱ a、GPⅥ、GPⅣ是血小板表面的3种胶原受体，GPⅠa/Ⅱa和GPⅥ的基因多态性和阿司匹林抗血小板活性减低有关，但是近年的研究并未发现GPⅠa/Ⅱa和GPⅥ基因多态性与缺血、出血事件明显相关的结论[18]。GPⅢa是血小板表面的受体蛋白，其最常见的等位基因亚型是PLA1和PLA2。PLA2位点的外显子2位置的T突变为C，从而导致GPⅢa蛋白的第33个位点从脯氨酸变成了亮氨酸。研究表明，PLA2基因突变可增加血小板表面的GPⅢa对纤维蛋白原的反应，使血小板聚集，导致阿司匹林抵抗[20]。

3 出血相关易感基因的检测

随着全基因组关联研究(GWAS)等技术被应用于大样本的群体遗传学研究，遗传学机制在脑出血发病中所具有的重要作用被逐步阐明。这将有助于筛查出高危人群，并对高危人群发生脑出血风险进行预测，对于疾病预防及指导临床诊疗均具有重要的意义。根据来自不相关个体的全基因组数据进行的遗传力估计，多达30%的脑出血风险可以通过常见和罕见的遗传变异来解释[21]。

3.1APOE等位基因 候选基因研究发现，APOE中的epsilon变体是脑出血的重要遗传危险因素。APOE位于19号染色体上，在一般群体中有3个等位基因，即epsilon 2、epsilon 3和epsilon 4，等位基因频率分别为7%、81%和14%。有研究表明，APOE epsilon 2和epsilon 4在自发性和华法林相关出血中明显增加了第1次和复发性脑出血的风险，与大叶脑出血的风险增加密切相关[22]。一项小范围的候选基因研究发现，epsilon 2和epsilon 4纯合的患者复发脑出血的风险分别为41%和27%，而纯合的epsilon 3复发风险为10%[23]。

3.2PMF1和SLC25A44等位基因 国际卒中基因组联合会于2014年完成首个关于脑出血的GWAS，这一多中心研究纳入了1 545例(664例脑叶出血和881例非叶型脑出血)和1 481例对照者，并确定1q22为非叶型脑出血的第1个非家族性遗传危险位点，该区域内最高的关联位点是rs2984613，其等位基因频率为32%[24]。关于1q22与非叶型脑出血之间的生物学机制尚待阐明，1q22区内包含PMF1和SLC25A44两个基因。PMF1编码多胺调节因子，该蛋白在有丝分裂过程中对染色体的排列和运动的形成起着重要的作用，PMF1在细胞核内发挥作用，其功能受多胺调节。PMF1还能诱导对多胺分解代谢途径起限速作用的乙酰转移酶的转录，来调控多胺的代谢[25]。多胺在脑卒中患者中升高，并与动物模型中血-脑屏障的破坏有关。SLC25A44在神经组织中表达较高，编码一种线粒体转运蛋白。有研究表明，线粒体基因遗传变异的产物能够干预氧化磷酸化与非叶型脑出血的关系[26]。

3.3COL4A1和COL4A2等位基因 COL4A1和COL4A2均位于染色体13q34区。一项研究发现，COL4A1中的变异体COL4A1(P352L)和COL4A1(R538G)仅存在于自发性脑出血病例中[27]。由于COL4A1与COL4A2编码的蛋白质在结构和功能上是相互联系的，另一项研究评估了同一群体中的遗传变异，发现3个罕见的非同义编码变异体COL4A2(E1123G)、COL4A2(Q1150K)和COL4A2(A1690T)仅存在于脑出血患者中[28]。COL4A2内的一个内含子位点与非叶型脑出血的风险密切相关，rs9521733是该位点内最相关的SNP，会导致这类脑出血的风险增加29%。研究发现，COL4A1及COL4A2基因与散发性脑小血管病密切相关，COL4A1突变的患者可在中年时出现自发性脑出血症状，并且在合并头部创伤、过度活动及服用抗凝药物等时容易发生反复脑出血[29]。

4 精准医疗

溶栓治疗后出血转化的风险评估模型显示，患者的年龄、入院高血糖、高血压、心房纤颤、心力衰竭、肾功能障碍、糖尿病、缺血性心脏疾病、既往使用抗血小板药物等均与出血转化风险增加相关[30]。近年来，国内外相继出现各种预测静脉溶栓后出血转化的评分系统，得到临床医生们的广泛重视。目前主要应用于临床的评估模型有以下5种：GRASPS模型、HAT模型、SEDAN模型、MSS模型和SITS模型[31]。这5种评分系统均为国外研究总结出的评分系统，谷远峰等[32]比较了5种评分系统对急性缺血性脑卒中静脉溶栓后出血转化风险预测差异，5种评分系统均可以预测中国人群中脑梗死患者静脉溶栓后发生出血转化的风险，其中GRASPS模型有相对较好的预测价值。当下需要以我国患者为研究样本的大样本临床研究，综合我国患者情况来评估影响脑梗死患者静脉溶栓后出血转化发生的影响因素，制订一个精准、快速、简便的风险评估模型。

5 小结与展望

脑梗死作为中老年人的多发疾病，有着起病急，进展快的特征。抗凝药物与抗血小板药物都是脑梗死治疗的重要组成部分，且用药量个体差异明显，需要根据患者不同基因型来定制最佳的用药方案，以减少再次发生血栓和出血风险，达到最佳治疗效果。出血转化的发生也与遗传因素相关，多个基因的变异可增加脑出血的风险。溶栓治疗是一把“双刃剑”，大部分患者能够获得明显的临床效益，而少数患者会因溶栓导致出血转化，带来残疾和死亡的风险。年龄、血糖、血压等因素都会增加出血转化的风险，目前国际上已有多种评估模型来预测出血转化的风险，但还未在我国广泛应用，当下应该根据我国患者情况，结合已有的评估模型，并纳入遗传因素和药物基因组因素来制订一个适用于我国患者的风险评估模型，通过合理治疗来减少出血转化的风险。